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CD133+造血祖细胞对大肠癌细胞生物学特性的影响与探讨

作　者: 周春平
导　师: 李学农
学　校: 南方医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 结直肠癌 CD133~+造血祖细胞脐血侵袭转移 TR-7
分类号: R735.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景和目的：大肠癌(Colorectal cancer,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一。近年来,由于生活饮食习惯改变的原因,我国大肠癌的发病率和死亡率不断呈逐渐上升趋势,而侵袭和转移是导致患者死亡的主要原因。肿瘤的发生和发展是一个多因素、多步骤、多基因共同作用的复杂过程。肿瘤细胞和宿主之间的相互作用是肿瘤发生发展的内在因素,肿瘤细胞转移具有一定的器官倾向性,这可能是瘤细胞与特定的器官微环境相互作用相互选择的结果。肿瘤转移取决于肿瘤细胞本身的分子特性和其分泌的因子对周围间质细胞的影响,包括血管、结缔组织和免疫细胞等。特殊的肿瘤微环境通过各种调节机制影响着肿瘤细胞的生长发展和侵袭转移。因此,肿瘤转移不只是肿瘤细胞本身的生物学特性及遗传特性所决定,从根本上说是癌细胞与宿主相互作用的结果,宿主甚至起决定性作用。造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell)是造血组织具有自我复制和分化潜能的原始细胞。最初CD34+抗原被认为是造血祖细胞的重要标志,该抗原在原始造血细胞表达旺盛,后随细胞分化而逐渐减弱。对祖细胞表面标志性抗原的初步研究发现,CD133+细胞较CD34+细胞具有更强的增殖潜能且包含有更高比例的长期培养起始细胞,在正常骨髓微环境条件下CD133+细胞可能比CD34+细胞具有更强的趋化和迁移能力,CD133+造血祖细胞可能代表了更原始的造血细胞。Kaplan RN发现了VEGFR1阳性造血祖细胞(vascular endothelial growth factor receptor1positive hematopoietic progenitor cell, VEGFR1+HPC)在动物肿瘤转移中起到决定的作用,VEGFR1+HPC并非以前发现的血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cell, EPC)即VEGFR2阳性造血祖细胞,而是同时具备CD133和VEGFR1两种标记的一种造血祖细胞,因为腹腔注射VEGFR2抗体,不能阻断VEGFR1+HPC细胞簇形成及瘤转移灶形成,只能限制肿瘤转移灶生长。利用β半乳糖苷酶标记骨髓细胞移植的小鼠Lewis肺癌模型、小鼠B16黑色素瘤模型和c-myc转基因小鼠自发性淋巴瘤模型发现：VEGFR1+HPC首先在特定器官形成细胞簇(VEGFR1+HPC cellular clusters),为瘤细胞准备了易于形成转移的微环境,这些细胞簇形成部位与肿瘤转移常见部位一致。肿瘤转移到某种特定器官的细胞和分子机制还不是很清楚,但是很多肿瘤都有转移到某一特定器官的倾向。依靠肿瘤转移相关细胞标签-VEGFR1+造血祖细胞在靶器官形成转移的微环境,促进了肿瘤的侵袭和转移。但目前的研究均采用动物受致死性辐射后进行骨髓移植的研究方法,各器官存在辐射损伤后可能会造成非特异性骨髓动员及骨髓来源细胞的聚集,且尚未在人癌实验层次获得证实。脐带血,是指胎儿出生后,残留在脐带和胎盘绒毛血管内的血液。在胚胎发生过程中,32周胎龄前的胎儿循环中含有丰富的造血祖细胞,至34周龄时大部分的已完成迁移,但在出生前胎儿的血循环中仍含有较多的造血祖细胞成分,只出生数月后才降至成人外周血水平,脐血中的造血祖细胞的抗原性较弱,移植相关的并发症的发生率较骨髓和外周血少,且症状轻,采集保存容易,对供者无任何伤害,因此被认为是极具潜力的新的造血祖细胞来源人CD133高亲和肽TR-7是本课题组前期在筛选出鼠高亲和肽的基础上筛选出来的,经证实能与人细胞上的CD133特异结合。本研究重点探讨1, CD133+造血祖细胞对结直肠癌增殖、侵袭及转移的影响,阐明CD133+造血祖细胞在结直肠癌转移中的主要生物学功能以及大肠癌动员CD133+造血祖细胞进入血液循环进而进入转移灶的原理,为揭示结直肠癌转移机制及抗转移治疗奠定基础。2,人CD133高亲和肽TR-7,CD133+造血祖细胞与大肠癌细胞共培养,以检测人CD133高亲和肽对CD133+造血祖细胞的体外的拮抗的生物学效应利用CD133高亲和肽与人肿瘤细胞共培养的方式分别对其增殖、粘附及体外运动能力进行检测。方法1.CD133+造血祖细胞的筛选、鉴定及培养取自南方医院产科新生胎儿新鲜脐血标本20例,抗凝保存,并均在脐血采集后2小时内,采用人淋巴细胞分离法,分离取出单个核细胞,再利用CD133+免疫磁珠分离法,分离出CD133+造血祖细胞,并分别予流式细胞仪及免疫细胞染色分析和鉴定样本量中CD133+细胞含量,同时在减少诱导CD133+分化的同时,培养CD133+造血祖细胞。2.CD133+造血祖细胞对结直肠癌细胞生物学特性的影响将CD133+造血祖细胞与SW480共趋化培养,用MTT法检测肿瘤细胞的增殖及黏附能力的影响,用Transwell小室法检测肿瘤细胞的迁移能力的变化,。观察CD133+造血祖细胞作用前后细胞增殖、体外侵袭变化3.CD133高亲和肽对CD133+造血祖细胞作用的拮抗,在上一步的试验中,加入CD133高亲和肽利用平板克隆形成实验检测CD133高亲和结合肽对大肠癌细胞体外增殖能力的影响；应用细胞粘附实验测定细胞在纤维粘连蛋白(Fibronectin, FN)上的粘附性、应用运动小室实验、细胞划痕实验检测该短肽对大肠癌细胞运动迁移能力的影响。利用One-Way ANOVA检验对平板克隆形成实验、细胞粘附实验、细胞运动实验的数据进行处理与分析,应用LSD、Dunnett’s T3多重比较来进一步比较分析结果1、CD133+造血祖细胞的筛选、鉴定及培养由取自南方医院产科,脐血标本共20份(其中18份成功提取新鲜细胞,2份失败),50-80ml/份,5%枸橼酸抗凝,新鲜脐血采集后2h内,分离出CD133+造血祖细胞。从新鲜的脐血中得到的单个核细胞数平均为(1.43±0.17)×107/ml,经CD133磁珠分离系统分离得CD133+富集细胞的平均数为(1.32±0.01)×105/ml,新鲜脐血单个核细胞中的CD133+细胞所占比例为(0.8±0.01)%,经流式细胞仪鉴定CD133+CD34+细胞纯度达到80%以上。CD133+细胞培养一周后,免疫细胞化学染色CD133,显微镜下观察CD133阳性细胞数>90%。2、CD133+造血祖细胞对结直肠癌细胞生物学特性的影响CD133+造血祖细胞能显著促进SW480细胞的生长(n=60、Z=-6.106、P=0.000),能促进肿瘤细胞的形态学改变,即肿瘤细胞的核深染,异型明显,细胞呈多角形或不规则形,能显著促进SW480细胞的迁移能力；细胞黏附实验表明,含有CD133+造血祖细胞的实验组其肿瘤细胞的黏附能力明显高于对照组(n=60、Z=-3.679,P=0.000)。利用丙酮沉淀法提取细胞总蛋白(即浓缩蛋白)检测MMP-2、VEGFR-1及E-Cadherin蛋白表达情况发现实验组中的3种蛋白表达水平均高于对照组。3、不同浓度的TR-7短肽对共培养的各组大肠癌HT-29细胞增殖能力没有明显作用,增殖能力差异没有统计学意义(F=1.473,P=0.347)。而且各组肿瘤细胞的克隆形成率实验结果表明四组细胞增殖能力的差异有统计学意义(F=0.174,P=0.000)。通过对粘附能力的检测,不同浓度TR-7对SW480、SW620细胞粘附能力影响的差异没有统计学意义(Fht=29=0.428, P ht-29=0.738;Fsw620=3.109, P sw620=0.089)。Transwell细胞运动实验显示不同浓度梯度TR-7共培养后的SW480、 SW620、Lovo细胞,穿过膜的细胞数显著减少,不同浓度组间具有显著差异,差异具有统计学意义。并且TR-7浓度越大穿膜的细胞数越少,对细胞运动能力的影响越明显。细胞划痕实验进一步证实随着TR-7短肽浓度的增加,lovo细胞划痕部位迁移的细胞数越少。结论1、CD133+造血祖细胞可显著促进人结直肠癌细胞的增殖及侵袭能力,CD133+造血祖细胞与人结直肠癌细胞裸鼠共移植具有促转移作用,初步证明,人造血祖细胞可能对人结直肠癌细胞转移形成具有重要影响。2、CD133+造血祖细胞可与结直肠癌细胞直接作用,能促进转移相关基因和血管生成因子MMP-2、VEGFR-1蛋白高表达,同时调节E-Cadherin的蛋白表达,初步表明：CD133+造血祖细胞的促转移作用可能与转移相关因子MMP-2、 VEGFR-1及E-Cadherin的表达有关。3.CD133高亲和肽CR-7能阻断CD133造血祖细胞对肿瘤细胞的促进作用。

全文目录

摘要  3-8
ABSTRACT  8-16
前言及研究思路  16-23
第一章 CD133~+造血祖细胞对SW480细胞生物学特性的影响  23-43
  一材料与方法  23-28
  二结果  28-35
  三讨论  35-41
  参考文献  41-43
第二章人CD133高亲和肽对CD133~+造血祖细胞的拮抗作用的研究  43-60
  一主要仪器与材料  43-44
  二主要实验方法  44-46
  三结果  46-57
  四讨论  57-58
  参考文献  58-60
全文小结  60-61
英文缩略语对照表  61-62
攻读硕士学位期间成果  62-63
致谢  63-64

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