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不同途径移植HUCBMNCs对脑出血大鼠神经功能的影响及其在脑内的归巢

作　者: 姚星宇
导　师: 张国华
学　校:
专　业: 神经病学
关键词: 脐带血单核细胞荧光示踪剂神经巢蛋白神经元特异性烯醇化酶神经样细胞脑出血大鼠途径神经功能归巢
分类号: R743.34
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

第一部分人脐血单核细胞中的神经样细胞研究及体外示踪研究目的研究人脐带血单核细胞(human umbilical cord blood mononuclear cells，HUCBMNCs)中是否存在神经样细胞；观察同时应用细胞膜标记物CM-DiI、细胞核标记物DAPI联合示踪HUCBMNCs的可行性及双标后HUCBMNCs体外培养过程中细胞形态及活性的变化。方法采集30例新生儿的脐带血，采用密度梯度离心法分离出单核细胞，免疫荧光染色法观察新鲜HUCBMNCs中神经巢蛋白(nestin)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)的表达；对新鲜HUCBMNCs用示踪剂CM-DiI及DAPI进行双标记，体外分别培养未加示踪剂及双标后的HUCBMNCs，倒置相差显微镜下观察细胞形态变化及不同时间经CM-DiI和DAPI双标的HUCBMNCs荧光染色阳性数，台盼蓝染色检测不同时间细胞活性。结果新鲜分离的HUCBMNCs有少数nestin、NSE表达阳性的细胞（2~4个/高培视野）；未加任何诱导剂培养10~12d时，在HUCBMNCs中有3~5个/HP胞体较大、有数个类似轴突和树突状粗长突起的神经样细胞；新鲜分离的HUCBMNCs在CM-DiI和DAPI联合标记15min后，荧光显微镜下可见标记细胞的细胞膜、细胞核分别在不同波长下呈现红色和蓝色的荧光；CM-DiI/DAPI双标后的HUCBMNCs体外培养1，3，7，14，21d，CM-DiI和DAPI双染的阳性细胞数各时间点比较差异无显著性意义；台盼蓝染色观察HUCBMNCs存活率为95.6%~98.8%，双标后的HUCBMNCs体外培养过程中细胞形态变化与未经示踪标记的HUCBMNCs相比差异不明显，仍保持了良好的生长状态、贴壁能力和细胞增殖能力。结论新鲜分离的HUCBMNCs中有少数神经样细胞；CM-DiI和DAPI可有效标记HUCBMNCs，两种示踪剂对活细胞无毒不良反应，荧光衰减较慢，适用于HUCBMNCs标记及示踪。第二部分不同途径移植HUCBMNCs对脑出血大鼠神经功能的影响及其在脑出血大鼠脑内的归巢目的观察经不同途径移植HUCBMNCs后不同时间点脑出血大鼠神经功能评分的变化及移植14天HUCBMNCs在脑内的归巢，以此探讨HUCBMNCs移植的最佳途径。方法采用自体血二次注血/退针法制作脑出血模型，经头CT检查证实脑出血模型构建成功。将从人脐血中分离出的新鲜HUCBMNCs经CM-DiI和DAPI联合体外双标后，分别经Wistar大鼠尾静脉、左心室及脑出血局部移植入脑出血大鼠体内，对照组自然转归。各组模型均于移植1、3、7、14天采用Longa评分法评价大鼠神经功能，并将尾静脉、左心室及脑出血局部组模型于移植14天内灌注取脑，冰冻切片后通过荧光显微镜观察HUCBMNCs在大鼠脑内归巢情况。结果四组大鼠神经功能评分经统计学处理后提示不同时间点大鼠的神经功能评分差异有显著性（F=131.87，P＜0.001）；移植时间（time）与移植方法（group）的交互效应显示不同的治疗方法时间趋势相同（F=35.54，P＞0.05）；大鼠神经功能评分组间比较显示，不同移植方法对大鼠神经功能评分变化的差异有显著性（F=6.434，P=0.001）；HUCBMCs移植术后1天脑局部移植组大鼠神经功能评分（2.35±0.67）高于其他组，移植术后3、7、14天脑局部移植组大鼠神经功能评分（分别为0.40±0.60，0.25±0.37，0.03±0.22）低于其他组；移植3、7、14天3组大鼠神经功能评分差异有显著性（F值分别为5.59，22.94，11.07，其对应P值均＜0.01）；相同移植途径不同时间点多个样本均数之间比较各组差异有显著性（F值分别为27.71，29.07，92.11，13.47，其对应P＜0.001）；尾静脉与左心室移植组各时间点神经功能评分差别无显著性（P分别为0.85，0.08，0.70，0.68）；经尾静脉、左心室及脑出血局部移植的大鼠损伤脑组织部位均可见经CM-DiI和DAPI双标的人脐血单核细胞数分别为7.93±4.184、16.87±3.31、34.87±2.66个/高倍视野，经统计学处理提示三种移植途径归巢到损伤脑组织部位的HUCBMCs数差异有统计学意义（F值=458.762，P<0.05），各组间两两比较采用LSD-t检验，P值均<0.01。结论经尾静脉、左心室及脑出血局部途径移植HUCBMNCs治疗脑出血大鼠神经功能均有改善；经各途径移植的HUCBMNCs均可归巢到大鼠损伤脑组织内；脑局部移植是HUCBMNCs移植的最佳途径。

全文目录

中文摘要  4-6
ABSTRACT  6-9
第一部分  9-18
  材料与方法  10-12
  结果  12-15
  讨论  15-17
  结论  17-18
第二部分  18-26
  材料与方法  18-20
  结果  20-24
  讨论  24-26
  结论  26
参考文献  26-31
文献综述  31-45
  参考文献  39-45
英文缩略词表  45-46
攻读学位期间发表文章及科研情况  46-47
个人简历  47-48
致谢  48

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