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乳腺癌细胞特异性多肽的体内筛选和初步鉴定

作　者: 王瑞
导　师: 牛瑞芳
学　校: 天津医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 体内筛选噬菌体肽库乳腺癌细胞动物模型噬菌体展示技术
分类号: R737.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

背景与目的：乳腺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,在欧美发达国家乳腺癌发病率占女性恶性肿瘤首位,我国每年也有20万女性死于乳腺癌,且发病率目前呈逐年上升和年轻化趋势,因此研究乳腺癌的诊断和治疗具有重要的意义。然而目前在肿瘤的常规药物治疗中,肿瘤治疗药物并非特异性作用于肿瘤组织,而是同时作用于健康组织和器官,给机体带来很大的毒副作用。近些年来,肿瘤的靶向治疗越来越受到重视,如Herceptin, Rituxan, Remicade等靶向药物现已应用于肿瘤的临床治疗,并取得不错的疗效。噬菌体展示肽库技术是一种有效地筛选和扩增生物大分子配体的生物技术,通过多轮的噬菌体展示筛选和测序,可以获得能与靶分子特异结合的短肽序列,目前广泛应用于靶向载体筛选、基因治疗、绘制人类血管分子图谱等方面。本研究利用噬菌体展示体内筛选技术,将噬菌体十二肽库注入TA Ⅱ系自发乳腺癌模型体内,筛选得到与乳腺癌细胞特异性结合的短肽,有望用于乳腺癌的临床诊断和治疗。材料与方法：第一部分：通过给TA Ⅱ小鼠皮下接种小鼠乳腺癌瘤株SBC,建立乳腺癌动物模型；通过噬菌体随机十二肽库对乳腺癌模型进行四次体内筛选,回收移植瘤和对照组织(肝)中的噬菌体,并最终获得与乳腺癌结合的噬菌体克隆。第二部分：获得乳腺癌结合的噬菌体单克隆后,通过提取噬菌体克隆DNA,设计引物,PCR获得目的片断,送公司测序,得到乳腺癌结合的多肽的序列。同时通过免疫组化的方法观察噬菌体肽段与肿瘤组织的结合部位,并初步观察其与人乳腺癌细胞结合的情况。结果：第一部分：1.鼠源性乳腺癌肿瘤组织接种小鼠皮下一周后,肿瘤组织出现直径0.2cm的粉红色突起,27天左右小鼠肿瘤直径约0.9cm。2.通过噬菌体随机十二肽库对乳腺癌模型进行四次体内筛选后,回收噬菌体数量由第一次筛选的8×104到最后一次的3.29×105,足第一次回收量的4.1倍3.第四次体内筛选中,与肿瘤组织结合的噬菌体数量是与肝组织结合的噬菌体数量的14倍。第二部分：1.测序分析结果表明,10个克隆中十二肽ASANPFPTKALL (G1)出现8次,频率较高,而PSANPFPTKALL (G2)仅出现2次。2.免疫组化分析发现,特异性噬菌体G1与乳腺癌细胞胞浆和胞膜均有结合。3.将G1克隆扩增,注入乳腺癌模型体内后,得到与肿瘤结合的噬菌体是与肺组织结合量的7.6倍,肝组织的14倍,心脏组织的6倍,肾的5.2倍。4.免疫细胞化学染色发现,G1与人乳腺癌MDA-MB-231细胞的胞浆和胞膜结合。结论：1.通过四次筛选,得到的噬菌体克隆包含十二肽段ASANPFPTKALL噬菌体克隆(G1)次数最多,G1可能是与乳腺癌细胞特异性结合的十二短肽。2.与肝脏、肺、肾组织相比,G1与乳腺癌组织的结合力最强,从而证明其与乳腺癌细胞能够特异性结合。3.G1不仅能与鼠源性乳腺癌细胞结合,而且能够和人乳腺癌MDA-MB-231细胞结合。4.筛选得到的与乳腺癌细胞特异性结合的短肽,有望用于乳腺癌的临床诊断和治疗。

乳腺癌细胞特异性多肽的体内筛选和初步鉴定

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