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乳腺癌中MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1和MAGE-C2基因的表达及其表达机制的研究

作　者: 侯淑芸
导　师: 单保恩
学　校: 河北医科大学
专　业: 免疫学
关键词: 乳腺癌 MAGE-A9 MAGE-A11 MAGE-C1 MAGE-C2 5-aza-CdR TSA
分类号: R737.9
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


乳腺癌是当代影响女性健康最严重的疾病之一，近年来在我国的发病率呈上升趋势。乳腺癌目前的治疗仍以手术治疗为主，放、化疗和内分泌治疗为辅。然而这些治疗方法对于肿瘤的复发、转移以及晚期肿瘤，却难以获得理想疗效，因此建立特异性的肿瘤免疫疗法，使其成为重要的辅助治疗甚至主要治疗手段，是目前研究的热点。癌/睾丸抗原（CTA）是肿瘤相关抗原的一种，其在除睾丸和胎盘以外的正常人体组织中均不表达，但在多种不同组织类型的肿瘤中有较高的表达，因此，CTA可作为肿瘤特异性免疫治疗的理想靶点。MAGE是CTA的一个亚家族成员，和CTA有着相同的表达模式，其编码的抗原在细胞内经加工产生抗原肽，与HLA-Ⅰ类分子结合成复合物，可被自体细胞毒性T淋巴细胞（CTL）特异性识别，诱导出对相应肿瘤细胞的特异性杀伤，从而达到治疗肿瘤的目的。导师所领导课题组近年来一直致力于对MAGE家族的研究。本研究首次采用RT-PCR和免疫组织化学方法对60例乳腺正常组织、60例乳腺良性病变（纤维瘤及腺病）以及60例原发性乳腺癌组织中MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1和MAGE-C2的mRNA及蛋白表达情况进行了研究，并分析其表达与乳腺癌临床病理学指标以及预后之间的关系；应用不同浓度的DNA甲基化抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理两种乳腺癌细胞株，观察药物处理前后MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1、MAGE-C2基因表达水平的变化，初步探索MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1、MAGE-C2表达的分子生物学机制。主要研究内容和结果如下：第一部分肿瘤抗原MAGE-A9和MAGE-A11在乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌临床病理学指标和预后的关系目的：检测MAGE-A9和MAGE-A11在乳腺正常组织、乳腺良性病变以及乳腺癌组织中的表达，并分析其表达与乳腺癌临床病理学指标以及预后之间的关系。方法：采用RT-PCR和免疫组织化学的实验方法分别检测了MAGE-A9和MAGE-A11mRNA及蛋白在60例乳腺正常组织、60例乳腺良性病变和60例乳腺癌组织中的表达情况，并分析两者的表达与乳腺癌临床病理学指标（包括患者年龄、肿瘤大小、病理类型、组织学分级、临床分期、腋淋巴结转移、有无脉管瘤栓、ER、PR和HER-2）之间的关系。通过病例随访，分析MAGE-A9和MAGE-A11蛋白表达与乳腺癌患者预后之间的关系。结果：1MAGE-A9和MAGE-A11mRNA在乳腺正常组织、乳腺良性病变和乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌临床病理学指标之间的关系60例乳腺正常组织及60例乳腺良性病变中未见MAGE-A9和MAGE-A11mRNA的表达，而60例乳腺癌组织标本中MAGE-A9和MAGE-A11mRNA阳性表达率分别为45%和66.7%。MAGE-A9和MAGE-A11mRNA的表达与ER及HER-2的表达呈正相关。ER表达阳性的乳腺癌患者，其MAGE-A9和MAGE-A11mRNA的阳性表达率分别高于ER表达阴性的乳腺癌患者（A9: χ2=4.865，P=0.027;A11: χ2=5.742，P=0.017）。HER-2表达阳性的乳腺癌患者，其MAGE-A9和MAGE-A11mRNA的表达阳性率分别高于HER-2表达阴性的乳腺癌患者（A9: χ2=6.16，P=0.013; χ2=4.266，P=0.039）。MAGE-A9mRNA的表达与乳腺癌患者的年龄（χ2=2.372，P=0.366）、肿瘤大小（χ2=3.125，P=0.246）、病理类型（χ2=5.104，P=0.08）、临床分期（χ2=3.326，P=0.190）、组织学分级（χ2=1.304，P=0.562）、淋巴结转移（χ2=0.180，P=0.672）、瘤栓（χ2=2.095，P=0.148）及PR表达（χ2=1.358，P=0.244）均无相关性。MAGE-A11mRNA的表达与乳腺癌患者的年龄（χ2=0.399，P=0.895）、肿瘤大小（χ2=2.687，P=0.263）、病理类型（χ2=5.312，P=0.064）、临床分期（χ2=2.461，P=0.305）、组织学分级（χ2=0.525，P=0.893）、淋巴结转移（χ2=1.250，P=0.264）、瘤栓（χ2=0.549，P=0.459）及PR表达（χ2=0.601，P=0.438）均无相关性。2MAGE-A9和MAGE-A11蛋白在正常睾丸组织中的表达在正常睾丸组织中，MAGE-A9和MAGE-A11主要表达于初级精母细胞和精原细胞中，且主要定位于细胞质，部分定位于细胞核。3MAGE-A9和MAGE-A11蛋白在乳腺正常组织、乳腺良性病变、乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌临床病理学指标之间的关系MAGE-A9和MAGE-A11蛋白主要表达于乳腺癌细胞的胞质中，部分表达于细胞核，乳腺癌组织中MAGE-A9和MAGE-A11蛋白阳性表达率分别为43.3%和63.3%，而60例乳腺正常组织及60例乳腺良性病变中均未见MAGE-A9和MAGE-A11蛋白表达。MAGE-A9（r=0.967，κ=0.966，P=0.000）和MAGE-A11（r=0.929，κ=0.927，P=0.000）mRNA与蛋白表达具有一致性，呈正相关。MAGE-A9和MAGE-A11蛋白的表达与ER及HER-2的表达呈正相关，ER表达阳性的乳腺癌患者，其MAGE-A9和MAGE-A11蛋白的阳性表达率分别高于ER表达阴性的乳腺癌患者（A9: χ2=4.344，P=0.037; A11:χ2=4.311, P=0.038）。HER-2表达阳性的乳腺癌患者，其MAGE-A9和MAGE-A11蛋白的阳性表达率分别高于HER-2表达阴性的乳腺癌患者（A9: χ2=4.671, P=0.031; A11: χ2=5.967, P=0.015）。MAGE-A9蛋白的表达与乳腺癌患者的年龄（χ2=3.621，P=0.209）、肿瘤大小（χ2=4.188，P=0.116）、病理类型（χ2=4.186，P=0.122）、临床分期（χ2=2.658，P=0.273）、组织学分级（χ2=1.006，P=0.618）、淋巴结转移（χ2=0.045，P=0.832）、瘤栓（χ2=2.807，P=0.094）及PR表达（χ2=1.067，P=0.302）均无相关性。MAGE-A11蛋白的表达与乳腺癌患者的年龄（χ2=0.548，P=0.808）、肿瘤大小（χ2=2.943，P=0.231）、病理类型（χ2=3.257，P=0.203）、临床分期（χ2=4.232，P=0.117）、组织学分级（χ2=0.964，P=0.732）、淋巴结转移（χ2=3.062，P=0.08）、瘤栓（χ2=1.386，P=0.239）及PR表达（χ2=1.270，P=0.260）均无相关性。4MAGE-A9和MAGE-A11蛋白表达与乳腺癌患者生存率的关系MAGE-A9和MAGE-A11蛋白表达阳性的乳腺癌患者的生存率分别低于MAGE-A9和MAGE-A11蛋白表达阴性的乳腺癌患者（A9: χ2=5.348,P=0.021; A11: χ2=4.192, P=0.041）。结论：1乳腺正常组织和乳腺良性病变中均未发现MAGE-A9和MAGE-A11mRNA及蛋白的表达。乳腺癌组织中MAGE-A9和MAGE-A11mRNA表达阳性率分别为45%和66.7%，蛋白阳性表达率分别为43.3%和63.3%，提示MAGE-A9和MAGE-A11是肿瘤特异性抗原，可作为乳腺癌免疫治疗的靶点。2MAGE-A9和MAGE-A11mRNA和蛋白表达与乳腺癌患者的年龄、病理类型、组织学分级、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移、瘤栓、PR表达均无相关性，但与ER和HER-2的表达呈正相关。ER和HER-2表达阳性的乳腺癌患者，其MAGE-A9和MAGE-A11mRNA和蛋白的表达率明显高于ER和HER-2表达阴性的乳腺癌患者，提示MAGE-A9和MAGE-A11有望成为指导乳腺癌治疗及监测预后的重要指标。3MAGE-A9和MAGE-A11蛋白表达阳性的乳腺癌患者的生存率分别低于MAGE-A9和MAGE-A11蛋白表达阴性的乳腺癌患者，说明MAGE-A9和MAGE-A11高表达可能是乳腺癌患者不良预后的一个重要标志。第二部分肿瘤抗原MAGE-C1和MAGE-C2在乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌临床病理学指标和预后的关系目的：检测MAGE-C1和MAGE-C2在乳腺正常组织、乳腺良性病变以及乳腺癌组织中的表达，并分析其表达与乳腺癌临床病理学指标以及预后之间的关系。方法：采用RT-PCR和免疫组织化学的实验方法分别检测了MAGE-C1和MAGE-C2mRNA及蛋白在60例乳腺正常组织、60例乳腺良性病变和60例乳腺癌组织中的表达情况，并分析两者的表达与乳腺癌临床病理学指标之间的关系。通过病例随访，分析MAGE-C1和MAGE-C2蛋白表达与乳腺癌患者预后之间的关系。结果：1MAGE-C1和MAGE-C2mRNA在乳腺正常组织、乳腺良性病变和乳腺癌组织中的表达及其与乳腺癌临床病理学指标之间的关系60例乳腺正常组织及60例乳腺良性病变中均未见MAGE-C1和MAGE-C2mRNA的表达，而60例乳腺癌组织标本中MAGE-C1和MAGE-C2mRNA阳性表达率分别为43.3%和61.7%。MAGE-C1和MAGE-C2mRNA的表达与乳腺癌的组织学分级呈正相关，组织学分级为Ⅲ级的乳腺癌患者，其MAGE-C1和MAGE-C2mRNA阳性表达率分别高于组织学分级Ⅰ级的乳腺癌患者（C1: χ2=8.832, P=0.01;C2: χ2=8.575, P=0.01）。MAGE-C2mRNA表达还与乳腺癌的病理类型及瘤栓表达呈正相关。瘤栓表达阳性的乳腺癌患者，其MAGE-C2mRNA的阳性表达率高于瘤栓表达阴性的乳腺癌患者（χ2=6.094，P=0.014）。病理类型为浸润性导管癌的患者，其MAGE-C2mRNA的阳性表达率分别高于浸润性小叶癌和髓样癌的患者（χ2=11.707，P=0.002）。MAGE-C1mRNA的表达与乳腺癌患者的年龄（χ2=0.403，P=0.907）、肿瘤大小（χ2=0.976，P=0.671）、病理类型（χ2=2.256，P=0.352）、临床分期（χ2=0.684，P=0.765）、淋巴转移（χ2=0.102，P=0.75）、瘤栓（χ2=0.008，P=0.93）、ER（χ2=0.611，P=0.434）、PR（χ2=0.16，P=0.689）及HER-2表达（χ2=0.307，P=0.58）均无相关性。MAGE-C2mRNA的表达与乳腺癌患者的年龄（χ2=0.228，P=1.0）、肿瘤大小（χ2=0.579，P=0.815）、临床分期（χ2=4.059，P=0.115）、淋巴转移（χ2=2.303，P=0.129）、ER（χ2=0.004，P=0.947）、PR（χ2=0.000，P=1.0）及HER-2表达（χ2=2.366，P=0.124）均无相关性。2MAGE-C1和MAGE-C2蛋白在正常睾丸组织中的表达在正常睾丸组织中，MAGE-C1和MAGE-C2主要表达于初级精母细胞和精原细胞中，且主要定位于细胞质，部分定位于细胞核。3MAGE-C1和MAGE-C2蛋白在乳腺正常组织、乳腺良性病变、乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌临床病理学指标之间的关系MAGE-C1和MAGE-C2蛋白主要表达于乳腺癌细胞的胞质中，部分表达于细胞核，60例乳腺癌组织中MAGE-C1和MAGE-C2蛋白阳性表达率分别为38.3%和58.3%，而60例乳腺正常组织及60例乳腺良性病变中均未见MAGE-C1和MAGE-C2蛋白表达。MAGE-C1（r=0.902，κ=0.897，P=0.000）和MAGE-C2（r=0.933，κ=0.931，P=0.000）mRNA与蛋白表达具有一致性，呈正相关。MAGE-C1和MAGE-C2蛋白表达与乳腺癌的组织学分级呈正相关，组织学分级为Ⅲ级的乳腺癌患者，其MAGE-C1和MAGE-C2蛋白的阳性表达率分别高于组织学分级Ⅰ级的乳腺癌患者（C1: χ2=6.233, P=0.038;C2: χ2=7.471, P=0.017）。MAGE-C2蛋白表达还与乳腺癌的病理类型、瘤栓表达呈正相关。瘤栓表达阳性的乳腺癌患者，其MAGE-C2蛋白的阳性表达率高于瘤栓表达阴性的乳腺癌患者（χ2=5.503，P=0.019）。病理类型为浸润性导管癌的患者，其MAGE-C2蛋白的阳性表达率分别高于浸润性小叶癌和髓样癌的患者（χ2=10.889，P=0.004）。MAGE-C1蛋白的表达与乳腺癌患者的年龄（χ2=1.115，P=0.729）、肿瘤大小（χ2=1.659，P=0.435）、病理类型（χ2=3.173，P=0.206）、临床分期（χ2=0.383，P=0.87）、淋巴转移（χ2=0.012，P=0.914）、瘤栓（χ2=0.099，P=0.753）、ER（χ2=0.533，P=0.465）、PR（χ2=0.097，P=0.755）及HER-2表达（χ2=1.422，P=0.233）均无相关性。MAGE-C2蛋白的表达与乳腺癌患者的年龄（χ2=0.525，P=0.903）、肿瘤大小（χ2=0.359，P=0.936）、临床分期（χ2=4.022，P=0.15）、淋巴转移（χ2=1.143，P=0.285）、ER（χ2=0.429，P=0.513）、PR（χ2=0.07，P=0.791）及HER-2表达（χ2=1.936，P=0.164）均无相关性。4MAGE-C1和MAGE-C2蛋白表达与乳腺癌患者生存率的关系MAGE-C1和MAGE-C2蛋白表达阳性的乳腺癌患者，其生存率分别低于MAGE-C1和MAGE-C2蛋白表达阴性的乳腺癌患者（C1: χ2=4.213,P=0.04; C2: χ2=4.467, P=0.035）。结论：1乳腺正常组织和乳腺良性病变中均未发现MAGE-C1和MAGE-C2mRNA及蛋白的表达。乳腺癌组织中MAGE-C1和MAGE-C2mRNA阳性表达率分别为43.3%和61.7%，MAGE-C1和MAGE-C2蛋白阳性表达率分别为38.3%和58.3%，提示MAGE-C1和MAGE-C2可作为肿瘤标志物检测乳腺癌的发生，也可成为乳腺癌免疫治疗的理想靶点。2MAGE-C1mRNA和蛋白表达与乳腺癌患者的年龄、病理类型、临床分期、肿瘤大小、淋巴转移、瘤栓、ER、PR、HER-2表达均无相关性，MAGE-C2mRNA和蛋白表达与乳腺癌患者的年龄、临床分期、肿瘤大小、淋巴转移、ER、PR、HER-2表达均无相关性。MAGE-C1和MAGE-C2mRNA和蛋白表达与乳腺癌的组织学分级呈正相关。MAGE-C2mRNA和蛋白表达还与乳腺癌的病理类型、瘤栓表达呈正相关，提示MAGE-C1和MAGE-C2的表达和乳腺癌的恶性程度密切相关，且不同病理类型的肿瘤表达MAGE-C2的频率不同，以癌睾丸抗原为基础进行的肿瘤免疫治疗可能更适合在某些病理类型的肿瘤中进行。3MAGE-C1和MAGE-C2蛋白的高表达与乳腺癌患者的低生存率正相关，说明MAGE-C1和MAGE-C2高表达可能是乳腺癌患者不良预后的一个重要标志。第三部分乳腺癌中肿瘤抗原MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1和MAGE-C2表达机制的研究目的：应用DNA甲基化抑制剂5-aza-CdR和组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA单独或联合处理MCF-7、MDA-MB-231两种乳腺癌细胞，分析药物处理前后MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1、MAGE-C2基因表达的变化，初步探索它们表达的分子生物学机制。方法：将实验细胞分为4组：（1）对照组:同期培养的不加任何药物处理的细胞；（2）5-aza-CdR组：分别用含2.5μmol/L、5μmol/L5-aza-CdR的培养基培养细胞72h；（3）TSA组：分别用含0.3μmol/L、0.5μmol/L TSA的培养基培养细胞24h；（4）5-aza-CdR及TSA组：用含5μmol/L5-aza-CdR的培养基培养细胞48h后再加入含0.5μmol/LTSA的培养基继续培养24h。药物刺激72小时后，收集细胞，提取RNA，每组实验重复三次。结果：1药物处理前后MCF-7、MDA-MB-231细胞中MAGE-A9和MAGE-A11mRNA表达水平的变化RT-PCR结果显示，未经药物处理的MCF-7、MDA-MB-231细胞未见MAGE-A9和MAGE-A11mRNA表达。应用2.5μmol/L、5μmol/L5-aza-CdR分别作用72小时后可见MAGE-A9和MAGE-A11基因重新表达，且随着药物浓度增高，MAGE-A9和MAGE-A11基因表达逐渐增强。与单独应用5-aza-CdR相比较，联合应用5μmol/L5-aza-CdR和0.5μmol/L TSA可使MAGE-A9和MAGE-A11基因表达进一步增加。而0.3μmol/L、0.5μmol/L TSA单独作用均不能诱导出MAGE-A9和MAGE-A11基因的重新表达。2药物处理前后MCF-7、MDA-MB-231细胞中MAGE-C1和MAGE-C2mRNA表达水平的变化RT-PCR结果显示，未经药物处理的MCF-7、MDA-MB-231细胞未见MAGE-C1mRNA表达。单独应用2.5μmol/L、5μmol/L5-aza-CdR及0.3μmol/L、0.5μmol/L TSA均不能诱导出MAGE-C1基因的表达。而联合应用5μmol/L5-aza-CdR和0.5μmol/L TSA也未能诱导出MAGE-C1基因的表达。RT-PCR结果显示，未经药物处理的MCF-7、MDA-MB-231细胞未见MAGE-C2mRNA表达。应用2.5μmol/L、5μmol/L5-aza-CdR分别作用72小时后可见MAGE-C2基因重新表达，且随着药物浓度增高，基因表达逐渐增强。与单独应用5-aza-CdR相比较，联合应用5μmol/L5-aza-CdR和0.5μmol/L TSA可使MAGE-C2基因表达进一步增加。而0.3μmol/L、0.5μmol/L TSA单独作用均不能诱导出MAGE-C2基因的重新表达。结论：1单独应用5-aza-CdR处理MCF-7及MDA-MB-231细胞可诱导MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C2基因的表达，提示DNA去甲基化是MAGE-A9、MAGE-A11和MAGE-C2基因表达重要机制。2联合应用5-aza-CdR和TSA可使MCF-7及MDA-MB-231细胞中MAGE-A9、MAGE-A11和MAGE-C2基因的表达进一步增加，而TSA单独作用对基因表达没有影响，说明DNA去甲基化和组蛋白乙酰化在MAGE基因的表达中具有协同作用，DNA去甲基化扮演了主导作用。3单独或联合应用不同浓度的5-aza-CdR和TSA均不能诱导出MCF-7及MDA-MB-231细胞中MAGE-C1的表达，说明DNA甲基化和组蛋白乙酰化并不是调节MAGE基因表达的唯一机制。

全文目录


摘要  5-13
ABSTRACT  13-23
英文缩写  23-24
引言  24-26
第一部分 肿瘤抗原 MAGE-A9 和 MAGE-A11 在乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌临床病理学指标和预后的关系  26-60
  前言  26-27
  材料与方法  27-34
  结果  34-39
  附图  39-45
  附表  45-53
  讨论  53-55
  小结  55-57
  参考文献  57-60
第二部分 肿瘤抗原MAGE-C1和MAGE-C2在乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌临床病理学指标和预后的关系  60-94
  前言  60-61
  材料与方法  61-68
  结果  68-72
  附图  72-78
  附表  78-86
  讨论  86-88
  小结  88-90
  参考文献  90-94
第三部分 乳腺癌中肿瘤抗原 MAGE-A9、MAGE-A11、MAGE-C1 和MAGE-C2 表达机制的研究  94-118
  前言  94-95
  材料与方法  95-101
  结果  101-103
  附图  103-110
  附表  110-112
  讨论  112-114
  小结  114-116
  参考文献  116-118
结论  118-120
综述 黑色素瘤抗原基因研究进展  120-135
  参考文献  128-135
致谢  135-136
个人简历  136

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 乳腺肿瘤
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