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树突状细胞源性exosomes免疫糖尿病LDLr-/-小鼠抗动脉粥样硬化作用及其机制研究

作　者: 王新
导　师: 吴宗贵
学　校: 第二军医大学
专　业: 内科学
关键词: 动脉粥样硬化 糖尿病 LDLr-/-小鼠 糖基化低密度脂蛋白 免疫 exosome
分类号: R587.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


研究背景研究表明，动脉粥样硬化的发生发展除了炎症以及氧化应激的致病作用之外，同时存在着机体免疫系统的失衡，表现为一种自身免疫性疾病。而糖尿病作为动脉粥样硬化的等危征，加重动脉粥样硬化病变的进展，表现为更为严重的免疫反应紊乱。树突细胞是经典的抗原提呈细胞，介导了动脉粥样硬化中的适应性免疫应答。而在动脉粥样硬化的防治中，研究表明AS相关抗原疫苗的主动免疫，能起到缓解动脉粥样硬化进展的作用，而我们前期的研究表明在糖尿病合并动脉粥样硬化的LDLr-/-小鼠中，AGE-LDL的主动免疫亦能对其AS病变进展起到缓解作用。Exosomes作为亚细胞机构，拥有类似起源细胞的功能，并且其独特的生物学特性使得exosomes有可能克服以往蛋白质疫苗以及细胞疫苗的缺陷，因此其也成为目前疫苗研究的热点。研究目的本研究旨在研究AGE-LDL主动免疫后小鼠脾脏树突细胞源性exosomes是否能作为疫苗，起到缓解动脉粥样硬化病变进展的作用以及exosomes缓解动脉粥样硬化病变进展的可能机制。研究方法（1）选取6周龄LDLr-/-小鼠分成PBS对照组（n=6）以及AGE-LDL免疫组（n=6），普通饲料适应性喂养2周后给予高脂饮食，于第9周时以25ug剂量AGE-LDL（联合氢氧化铝佐剂）皮下免疫小鼠，等量PBS作为对照，每2周加强免疫一次，共加强3次。第17周，麻醉小鼠后无菌分离脾脏并心脏取血，分离主动脉油红染色，Elisa测定各小鼠血清AGE-LDL特异性抗体滴度，通过磁珠法分离小鼠脾脏树突状细胞并进行后续培养，AGE-LDL刺激后，抽提两组树突细胞培养上清exosomes，以BCA法测定exosomes蛋白含量，并通过流式对exosomes进行鉴定。（2）选取另一批6周龄LDLr-/-小鼠分成3组，即PBS对照组（n=8），exo对照组（n=10），exo免疫组（n=11），适应性喂养2周后开始高脂饮食，第9周时予1ug剂量的exosomes皮下免疫，等量PBS注射作为对照，每2周加强一次，共加强2次。第15周时，所有小鼠腹腔注射STZ（50mg/kg），连续注射6日建立糖尿病模型，第25周为实验终点。处理小鼠后收集血清，通过自动生化仪测定小鼠血脂情况，快速蛋白液相色谱仪测定血清脂蛋白分布。分离小鼠全长主动脉，通过油红染色观察不同组小鼠动脉斑块面积情况；留取小鼠主动脉根部制作冰冻切片，油红染色观察根部AS斑块面积，并通过Masson、MOMA-2染色观察斑块的胶原及巨噬细胞组成评价斑块稳定性。通过流式细胞术检测小鼠脾脏T淋巴细胞免疫表型（Th1/2/17及Treg）的变化，通过血清样本Elisa检测三组血清IgG总抗体及AGE—LDL特异性抗体IgG滴度的变化情况。最后通过定量PCR分析脾脏淋巴细胞免疫相关因子的表达情况。统计学处理方法：数据用SPSS18.0统计软件进行分析，P<0.05为差异具有统计学意义。研究结果（1）磁珠分选脾脏树突细胞，AGE-LDL刺激后CD11c阳性率95.34%，CD86阳性率78.62%，MHC-II阳性率83.05%，CD40阳性率82.31%，其分泌的exosomes经过流式鉴定，CD63阳性率18.73%，CD11C阳性率9.41%，CD86阳性率为25.79%，MHC-II阳性率7.03%，，结果表明得到了树突细胞源性的exosomes。（2）通过AGE-LDL免疫后小鼠树突细胞源性exosome的主动免疫，能起到抗动脉粥样硬化进展的作用：小鼠血脂分析示，exo免疫组高密度脂蛋白较exo对照组以及PBS对照组升高有统计学差异，同时两注射exosomes组其非高密度脂蛋白较PBS对照组为低；主动脉全长油红染色示，exo免疫组斑块面积相较于对照exo组及PBS对照组分别减少44%及54%（p<0.05），而exo对照组与PBS对照斑块面积无明显差异；主动脉根部冰冻切片油红染色示，exo免疫组斑块面积亦较对照exo组及PBS对照组较少达25%及34%（p<0.05），而对照exo组及PBS对照组无明显差异，三组Masson、MOMA-2染色结果未见明显差异，。（3）通过树突细胞源性exosome的主动免疫，能通过免疫调节机制起到抗动脉粥样硬化进展的作用：exo免疫组Th1型淋巴细胞比例较对照exo组及PBS对照组降低（p<0.05），exo免疫组及对照exo组Th2型淋巴细胞比例较PBS对照组增高（p<0.05），但exo免疫组及对照exo组间无统计学差异，三组Th17以及Treg比例无明显差异。小鼠血清抗体滴度检测示exo免疫组AGE-LDL特异性抗体滴度相比exo对照组及PBS对照组增高（p<0.05），而三组小鼠IgG总抗体滴度水平无明显差异。qPCR结果示exo免疫组IFN-γ mRNA表达量较对照exo组及PBS对照组降低（p<0.05），而IDO-1mRNA表达量较对照exo组以及PBS对照组升高（p<0.05）。研究结论我们的研究表明，主动免疫AGE-LDL之后能发挥抗动脉粥样硬化进展的作用。而采用免疫AGE-LDL以后脾脏树突细胞源性exosome的主动免疫亦能起到相类似的作用，主要体现在升高血清HDL，降低非高密度脂蛋白，并能抑制机体Th1型免疫反应，以及通过高表达吲哚2,3加氧酶起到抑制炎症的作用，表明树突细胞源exosome的主动免疫能起到缓解动脉粥样硬化病变进展的作用，并且其作为一种新的机制将树突细胞抗原提成与机体免疫应答反应联系起来，而参与到动脉粥样硬化的发生发展过程之中，为今后动脉粥样硬化的疫苗治疗提供了新的思路。

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病
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