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糖尿病视网膜病变患者纤维血管膜中SIRT1的表达及其相关机制初步研究

作　者: 刘姝林
导　师: 陈有信
学　校: 北京协和医学院
专　业: 临床医学
关键词: 糖尿病视网膜病变 SIRT1 白藜芦醇 二苯乙烯苷
分类号: R587.2
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


[目的]糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)是常见的糖尿病微血管并发症,为发达国家工作年龄人群中致盲率最高的疾病。SIRT1属于第Ⅲ组蛋白去乙酰化酶,与DR发病相关。本实验的目的为初步探讨SIRT1在DR纤维血管膜形成中的作用,研究SIRT1激动剂白藜芦醇是否对高糖培养的RPE细胞具有保护效应,及其相关机制。同时初步研究与白藜芦醇结构相近的二苯乙烯苷是否具有类似作用。[方法]采集DR伴眼底纤维血管膜患者、非糖尿病伴特发性黄斑前膜患者眼部标本,石蜡包埋切片,行免疫组化检测两组患者SIRT1表达的差异。体外培养人视网膜色素上皮细胞,加入5.5mmol/L葡萄糖,5.5mmol/L葡萄糖加上甘露醇,25mmol/L葡萄糖,25mmol/L葡萄糖及不同浓度白藜芦醇、二苯乙烯苷,分别检测以下指标的变化情况：(1)CCK-8法检测细胞活力；(2)RT-PCR检测SIRT1、PGC-1α基因表达水平；(3)Western blot检测乙酰化NF-κB p65含量及AMPK活性；(4)ELISA法检测VEGF分泌量。[结果]共收集DR患者纤维血管膜12例,非糖尿病患者黄斑前膜7例,纤维血管膜中SIRT1阳性率高于黄斑前膜组织(100%vs28.6%),去掉年龄因素影响后,差异具有统计学意义(p=0.021)。25mmol/L葡萄糖能降低人视网膜色素上皮细胞活力、抑制SIRT1及PGC-1α转录,激活NF-κB、抑制AMPK活性,促进VEGF分泌。加入一定浓度的白藜芦醇或二苯乙烯苷,可抑制高糖引起的细胞活力下降,减少SIRT1转录下降的水平,减少NF-κB的激活,VEGF分泌量也相应降低。同时,一定浓度的白藜芦醇及二苯乙烯苷可以减少高糖对PGC-1α转录的抑制作用,其幅度与对应的SIRT1、NF-κB改变水平并不完全一致,但与AMPK的活性变化量基本一致。[结论]DR患者纤维血管膜中SIRT1表达升高,提示SIRT1与DR新生血管有一定关系。但高糖可抑制体外培养的人视网膜色素上皮细胞中SIRT1的表达,上述实验结果提示体外实验可能不能完全反映视网膜的生理情况；或者DR病情进展过程中,SIRT1的含量在不断变化。本实验数据提示二苯乙烯苷可能也具有SIRT1激动剂的作用,且白藜芦醇及二苯乙烯苷可能是通过SIRT1—NF-κB通路降低VEGF分泌。同时PGC-1α mRNA水平可能与AMPK活性相关。

全文目录


目录  3-5
中文摘要  5-6
Abstract  6-8
前言  8-11
材料与方法  11-27
  1 实验试剂和细胞  11-15
    1.1 实验细胞  11
    1.2 主要实验试剂  11-14
      1.2.1 免疫组化试剂  11-12
      1.2.2 细胞培养试剂  12
      1.2.3 细胞活力测定试剂  12
      1.2.4 Western blot试剂  12-13
      1.2.5 RT-PCR试剂  13
      1.2.6 ELISA试剂  13
      1.2.7 抗体  13-14
      1.2.8 引物  14
    1.3 主要实验设备及仪器  14-15
  2 实验方法  15-27
    2.1 SIRT1免疫组化  15-17
    2.2 细胞培养  17-19
    2.3 细胞活力测定  19
    2.4 Western blot  19-22
    2.5 细胞总RNA的提取和RT-PCR  22-25
    2.6 酵联免疫吸附剂测定  25-27
实验结果  27-44
  1 糖尿病视网膜病变患者纤维血管膜中SIRT1阳性率高于对照组  27-30
  2 白藜芦醇及二苯乙烯苷可减轻高糖对ARPE-19的细胞活力的抑制作用  30-33
  3 白藜芦醇及二苯乙烯苷可减轻高糖对NF-κB的激活作用  33-35
  4 白藜芦醇及二苯乙烯苷可减轻高糖对AMPK的抑制作用  35-37
  5 白藜芦醇及二苯乙烯苷可减轻高糖对SIRT1转录的抑制作用  37-39
  6 白藜芦醇及二苯乙烯苷可减轻高糖对PGC-1α转录的抑制作用  39-41
  7 白藜芦醇及二苯乙烯苷可抑制高糖对VEGF的促分泌作用  41-44
讨论  44-48
  1 SIRT1与血管纤维膜的关系  44-45
  2 白藜芦醇及二苯乙烯苷可能通过SIRT1—NF-κB通路抑制ARPE-19细胞VEGF的分泌  45-46
  3 白藜芦醇及二苯乙烯苷激活AMPK、提高PGC-1α转录的机制  46-47
  4 白藜芦醇及二苯乙烯苷减轻高糖对ARPE-19细胞活力抑制作用的机制  47-48
结论  48-49
参考文献  49-55
缩略词表  55-57
致谢  57-58

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 内分泌腺疾病及代谢病 > 胰岛疾病 > 糖尿病性昏迷及其他并发症
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