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miR-214通过抑制HIF1AN的表达促进肝星状细胞的活化和迁移

作　者: 公绪华
导　师: 朱樑
学　校: 第二军医大学
专　业: 内科学
关键词: miR-214 肝星状细胞肝纤维化 HIF1AN
分类号: R575.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究背景与目的肝纤维化是各种慢性肝病发展到肝硬化必经的病理改变。肝星状细胞(hepaticstellate cell, HSC)的活化是肝纤维化发生、发展的中心环节，也是胶原蛋白沉积的关键因素。microRNA是在真核生物中发现的一类具有调控功能的内源性的非编码小分子RNA，在转录水平或转录后水平发挥调节作用。研究表明microRNA是慢性肝脏疾病进展过程中的重要调节因子。已有大量国内外文章报道miR-214在多种细胞内发挥着重要生物学调节作用，包括细胞增殖、凋亡、分化、脂肪代谢等。既往芯片数据显示miR-214在大鼠肝星状细胞活化过程中显著升高，本论文研究目的旨在研究miR-214在肝星状细胞活化过程中的调节作用，为肝纤维化的早期干预提供新的思路。本研究通过应用实时定量PCR技术，对肝星状细胞活化过程(静息状态—活化状态)、DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织(S0—S4期)、乙肝（HBV）相关肝纤维化病人各期肝组织(F0—F4期)以及TGF-β刺激前后的肝星状细胞进行miR-214表达水平检测，证实miR-214在肝星状细胞活化过程、DMN诱导大鼠肝纤维化模型、HBV相关肝纤维化病人肝组织标本以及TGF-β刺激后的肝星状细胞中显著升高，并与肝纤维化严重程度呈正相关。通过构建miR-214过表达及knockdown慢病毒载体，研究miR-214对大鼠肝星状细胞增殖、凋亡、迁移和活化功能的影响，并探讨可能的机制。研究共分三个部分：（1）肝星状细胞活化过程、DMN肝纤维化模型肝纤维化各期肝组织、乙型病毒肝炎（HBV）相关肝纤维化病人各期肝组织以及TGF-β刺激前后的肝星状细胞进行miR-214表达水平检测；（2）miR-214慢病毒载体（过表达及knockdown）对肝星状细胞增殖、迁移与活化功能的影响；（3）miR-214靶基因的验证。一、miR-214与肝星状细胞的活化密切相关目的：检测miR-214在不同状态肝星状细胞以及各期肝纤维化组织中的表达水平，了解miR-214与肝星状细胞活化以及肝纤维化进程的相关性。方法：分离培养原代肝星状细胞，收集24例不同分期的肝纤维化病人肝穿标本，并构建DMN诱导的肝纤维化动物模型，通过实时定量PCR技术检测肝星状细胞活化过程、DMN模型肝纤维化S0—S4期、乙肝相关肝纤维化病人各期肝组织(F0—F4期)以及TGF-β刺激前后的肝星状细胞中miR-214的表达水平。结果：成功分离、鉴定、培养原代肝星状细胞，根据形态学特征及活化标志物的表达，将HSC2d作为静息状态HSC，14d作为完全活化状态HSC；构建大鼠肝纤维化模型，根据肝组织病理结果，DMN给药第一到第四周分别对应肝纤维化S1-S4期。抽提细胞、组织RNA，采用实时定量PCR方法证实：miR-214在肝星状细胞活化过程、DMN诱导大鼠肝纤维化模型、HBV相关肝纤维化病人肝组织标本以及TGF-β刺激后的肝星状细胞中显著升高，并与肝纤维化严重程度呈正相关。miR-214在HSC活化过程中表达显著升高达26倍(P<0.01);以S0期肝组织作为对照组，S1-S4期组织中miR-214水平分别为对照组1.8倍、2.2倍、4倍、7.8倍(P<0.05);以F0期肝组织作为对照组，F1-F4期组织中miR-214水平分别为对照组5倍、9倍、6倍、7倍(P<0.01); TGF-β刺激后miR-214表达明显升高达刺激前7倍(P<0.05).二、 miR-214促进肝星状细胞的迁移与活化目的：研究miR-214在细胞分子水平对大鼠肝星状细胞增殖、迁移和活化功能的影响。方法：构建miR-214过表达及knockdown慢病毒；以不同MOI值(MOI取10到30)感染HSC-T6，应用荧光显微镜及实时定量PCR技术评估其感染效率；应用CCK-8检测细胞增殖，Transwell方法检测细胞迁移，real-time PCR、Western Blot方法检测肝星状细胞活化标志物Type I collagen与α-SMA mRNA与蛋白水平的表达。结果：成功构建miR-214过表达及knockdown慢病毒载体，MOI值=30时，慢病毒感染HSC-T6的效率达90%以上，real-time PCR检测miR-214过表达慢病毒感染HSC-T6后miR-214的表达量增加3倍(P<0.01)；与阴性病毒感染组（mock）相比，miR-214能显著促进肝星状细胞的迁移与活化，但是对细胞增殖无明显影响。三、miR-214靶基因的验证目的：探索miR-214在肝星状细胞中发挥生物学作用的可能机制。方法：采用生物信息学技术筛选相关靶基因，通过荧光质粒报告系统对靶基因HIF1AN进行验证；采用实时定量PCR、Western Blot检测miR-214过表达及knockdown组、肝星状细胞活化过程（静息状态-活化状态）中、TGF-β刺激前后以及乙型病毒肝炎（HBV）相关肝纤维化病人各期肝组织中HIF1AN的表达。结果：荧光质粒报告系统显示：miR-214可以显著抑制携有HIF1AN3’UTR的载体的荧光素酶活性达40%(P<0.001)；与阴性病毒感染组相比，miR-214过表达显著降低HIF1AN mRNA和蛋白的表达量(P<0.01)，miR-214knockdown显著增加HIF1ANmRNA和蛋白的表达量(P<0.05)；与静息状态（2d）肝星状细胞相比，HIF1AN在活化状态（14d）肝星状细胞中表达下降50%(P<0.001)；与TGF-β刺激前相比，TGF-β刺激后HIF1AN表达量下降35%(P<0.01)；与F0期病人肝组织相比，HIF1AN表达量与肝纤维化程度呈反比(P<0.05)。四、统计学分析数据用均数±标准差表示，数据由SPSS16.0软件统计包处理。多组间的比较用One-Way ANOVA方差分析。P<0.05认为有统计学差异。结论一、miR-214在肝星状细胞活化过程、DMN诱导大鼠肝纤维化模型、HBV相关肝纤维化病人肝组织标本以及TGF-β刺激后的肝星状细胞中显著升高，并与肝纤维化严重程度呈正相关。二、肝星状细胞中miR-214显著促进肝星状细胞的活化、迁移，但是对增殖并无影响。三、细胞、组织水平证实HIF1AN表达水平与miR-214呈负相关，进而推测miR-214对肝星状细胞生物学活性的调节可能是通过下调HIF1AN的表达实现的。

miR-214通过抑制HIF1AN的表达促进肝星状细胞的活化和迁移

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