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重金属镉免疫检测方法的研究

作　者: 王津
导　师: 王硕
学　校: 天津科技大学
专　业: 营养与食品卫生学
关键词: 重金属镉酶联免疫法胶体金免疫层析法水样品中药白芷样品
分类号: R446.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

随着现代工业的发展,重金属污染问题日益严重,对人类健康和生态环境造成了重大的影响。本文建立了一套用于监测中药中白芷和水样品中的重金属镉残留的快速检测技术,包括酶联免疫法(ELISA)和胶体金免疫层析测定法(CGIA),作为批量样品的筛选方法和现场检测的便捷工具。使用双功能螯合剂1-(4-异硫氰酸苄基)-乙二胺四乙酸(ITCBE)螯合重金属镉并偶联匙孔血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA),分别制得免疫原和包被抗原,免疫原免疫新西兰大耳白兔后,从兔子的血清中得到了针对重金属镉高特异性的多克隆抗体。在优化了包被抗原包被量、抗体稀释倍数、离子强度、pH值和封闭液的基础上,建立了重金属镉间接竞争ELISA标准抑制曲线,方法的灵敏度(IC50)为4.18gg/L,最低检出限LOD (IC15)为0.38μg/L。除了与重金属汞螯合物和铬螯合物的交叉反应分别为10.6%和1.8%外,与其他金属螯合物的交叉反应都小于0.3%。选取中药白芷、自来水和河水样品作为研究对象,进行了重金属镉在样品中的添加回收实验,结果表明重金属镉的平均回收率在90.54%-115.36%,变异系数在1.35%-9.33%之间。为了进一步验证ELISA方法的准确性,本文使用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)法检测样品中重金属镉的含量。在中药白芷样品中两种方法检测结果的线性回归方程为y=1.087x-0.029,R2为0.994。在水样品中两种方法检测结果的线性回归方程为y=0.987x-0.085,R2为0.986。以上结果表明本文建立的ELISA具有很高的准确度和精确度,适用于中药白芷和水样品中重金属镉的残留分析。同时,以胶体金作为抗体标记物,建立了免疫层析试纸条快速检测方法。采用柠檬酸三钠还原法制备粒径为20nm胶体金,优化好标记抗体的最适pH值和最适抗体量后,制备了胶体金标记的抗体并喷涂在玻璃纤维垫上作为结合释放垫。包被抗原和羊抗兔二抗分别作为检测带和质控带被固定在硝酸纤维素膜(NC膜)上,最后组装成条用于检测。本文建立的试纸条法的最低检出限(LOD)为5μg/L。选取自来水、河水作为研究对象,进行了加标检测,加标后的水样不需要任何前处理和稀释过程,直接用于试纸条检测。并将检测结果与ELISA的检测结果进行对比,结果表明两者有很好的一致性。该方法具有灵敏度高、检测快速、没有任何前处理过程,适用于现场检测水样中重金属镉残留。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-8
目录  8-11
1 前言  11-19
  1.1 重金属概述  11
  1.2 重金属污染  11-12
    1.2.1 环境中的重金属污染  11
    1.2.2 农产品的重金属污染  11
    1.2.3 重金属对动物性食品的污染  11-12
    1.2.4 食品加工中的重金属污染  12
  1.3 重金属镉概述  12-13
    1.3.1 镉的理化性质  12
    1.3.2 镉的来源  12
    1.3.3 镉的毒性与危害  12-13
    1.3.4 镉的限量标准  13
  1.4 重金属的常用检测方法  13-16
  1.5 免疫分析方法  16-17
    1.5.1 酶联免疫分析法  16
    1.5.2 胶体金免疫层析法  16-17
  1.6 本课题研究的目的及意义  17
  1.7 本课题的研究内容  17-19
2 材料与方法  19-31
  2.1 实验材料  19-22
    2.1.1 主要药品和试剂  19-20
    2.1.2 仪器及材料  20-21
    2.1.3 待测样品  21
    2.1.4 常用溶液的配制  21-22
  2.2 实验方法  22-31
    2.2.1 人工免疫原的制备  22
    2.2.2 包被抗原的制备  22
    2.2.3 抗体的制备  22-24
    2.2.4 酶联免疫检测方法的建立  24-25
    2.2.5 重金属镉抗体特异性的测定  25
    2.2.6 样品基质影响消除和添加回收实验  25-26
    2.2.7 重金属镉ELISA检测方法性能指标的评价  26-27
    2.2.8 电感耦合等离子体质谱法确证  27
    2.2.9 胶体金免疫层析试纸条的研究  27-31
3 结果与讨论  31-52
  3.1 免疫原偶联鉴定  31
  3.2 重金属镉抗体的制备  31-34
    3.2.1 抗血清的制备  31
    3.2.2 抗血清效价与特异性的测定  31-34
    3.2.3 重金属镉抗体的纯化及抗体浓度的确定  34
  3.3 间接竞争酶联免疫法的建立  34-37
    3.3.1 最适包被抗原包被量和抗体稀释倍数的优化  34-35
    3.3.2 离子强度的优化  35
    3.3.3 pH值的优化  35-36
    3.3.4 封闭液的优化  36-37
    3.3.5 ic-ELISA标准曲线的绘制  37
  3.4 重金属镉多克隆抗体特异性的测定  37-38
  3.5 ELISA法用于样品的检测  38-43
    3.5.1 中药白芷样品的基质影响消除实验  38-39
    3.5.2 中药白芷样品的添加回收实验  39-40
    3.5.3 自来水和河水样品的基质影响消除实验  40-42
    3.5.4 自来水和河水样品的添加回收实验  42-43
  3.6 重金属镉ELISA检测方法性能指标的评价  43-45
    3.6.1 检出限和灵敏度  43
    3.6.2 准确度  43
    3.6.3 精密度  43-45
  3.7 电感耦合等离子体质谱法确证  45-46
  3.8 胶体金质量的鉴定  46-47
  3.9 胶体金标记抗体的制备  47-48
    3.9.1 标记最适pH值的确定  47-48
    3.9.2 标记最适抗体量的确定  48
  3.10 包被抗原浓度、金标抗体稀释倍数和二抗稀释倍数的选择  48-49
  3.11 免疫层析试纸条检出限的确定  49-50
  3.12 免疫层析试纸条应用于水样的检测  50-52
4 结论  52-53
5 展望  53-54
6 参考文献  54-60
7 攻读硕士学位期间发表论文情况  60-61
8 致谢  61

重金属镉免疫检测方法的研究

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