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TGF-β1对巨噬细胞凋亡的影响及相关分子机制

作　者: 钟玉霞
导　师: 张学军
学　校: 天津医科大学
专　业: 免疫学
关键词: RAW264.7 凋亡 转化生长因子β1 脂多糖Toll样受体4
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


研究内容与目的：TGF-β1是Toll样受体(toll like receptor, TLR)信号通路中重要的负性调控因子,它可以诱导包括B细胞、嗜酸性粒细胞等多种类型的细胞发生凋亡,LPS刺激可促进巨噬细胞分泌TGF-β1,此外LPS刺激可诱导巨噬细胞发生凋亡且这种促凋亡作用与TLR4密切相关,然而关于LPS诱导巨噬细胞凋亡是否与促巨噬细胞分泌TGF-β1相关未有相关报道。本课题旨在观察TGF-β1是否具有调节LPS诱导巨噬细胞凋亡的作用,并在此基础上进一步探讨TGF-β1对TLR4受体表达以及对TLR4信号通路中相关信号分子的影响。研究方法与结果：本课题实验分三部分进行：第一部分检测TGF-β1对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响,包括以下三个实验：1.流式细胞仪检测LPS刺激对巨噬细胞凋亡的影响,ELISA检测LPS刺激后巨噬细胞分泌TGF-β1的情况：采用100ng/ml、1000ng/ml LPS刺激巨噬细胞12小时,检测结果显示,LPS诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡并促进RAW264.7分泌TGF-β1且这种作用有剂量依赖性；2.流式细胞仪检测TGF-β1对巨噬细胞凋亡的影响；分别用5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬细胞12小时,结果显示TGF-β1具有诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡的作用且有剂量依赖性；3.流式细胞仪检测TGF-β1对LPS诱导巨噬细胞RAW264.7凋亡的影响；100ng/ml LPS刺激的前提下分别加入Ong/ml、5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬细胞12小时,结果显示TGF-β1促进LPS诱导巨噬细胞发生凋亡,且为剂量依赖性。第二部分检测TGF-β1对炎性巨噬细胞TLR4表达的影响,实验采用流式细胞仪检测TLR4蛋白表达以及实时定量PCR(Real-time PCR)检测TLR4mRNA的表达水平,包括以下三个实验：1.检测LPS刺激对巨噬细胞TLR4表达水平的影响；首先检测100ng/ml、1000ng/ml LPS刺激巨噬细胞12小时TLR4的表达情况,结果显示LPS抑制巨噬细胞TLR4的表达,且有剂量依赖性；检测100ng/ml LPS刺激不同时间巨噬细TLR4的表达情况,结果显示100ng/ml LPS刺激6小时对巨噬细胞TLR4mRNA的抑制作用最显著,对TLR4蛋白表达的抑制作用在刺激12小时最显著；2.检测TGF-β1对巨噬细胞TLR4表达水平的影响；首先检测5ng/ml、10ng/ml TGF-β1刺激巨噬细胞12小时TLR4的表达情况,结果显示TGF-β1抑制巨噬细胞TLR4的表达；检测lOng/ml TGF-β1刺激不同时间巨噬细胞TLR4的表达情况,结果显示TGF-β1抑制巨噬细胞TLR4表达有时间依赖性；3.检测TGF-β1与LPS联合刺激对巨噬细胞TLR4基因和蛋白表达水平的影响：这部分实验分组如下：对照组,100ng/ml LPS组,10ng/ml TGF-β1组,LPS与TGF-β1联合刺激组,1μg/ml anti-TGF-β1组,LPS与anti-TGF-β1联合刺激组。检测结果显示,LPS与TGF-β1联合刺激对巨噬细胞TLR4基因及蛋白表达的抑制作用强于LPS或TGF-β1单独刺激组,anti-TGF-β1中和巨噬细胞分泌的TGF-β1可使LPS抑制TLR4的作用减弱,但不能完全阻断其抑制作用,此结果表明二者在抑制TLR4表达上具有相关性,但LPS抑制TLR4表达并非TGF-β1依赖。第三部分检测TGF-β1对TLR4信号传导中的相关信号分子表达的影响；实验采用Real-time PCR技术检测SOCS3mRNA以及BAMBI mRNA的表达。包括以下两部分实验：1.检测TGF-β1与LPS单独或联合刺激以及加入anti-TGF-β1以后LPS刺激对巨噬细胞SOCS3mRNA表达的影响,结果显示LPS或TGF-β1单独刺激具有促进SOCS3mRNA表达的作用,联合刺激与LPS或TGF-β1单独刺激组间区别无统计学意义,anti-TGF-β1与LPS联合刺激组SOCS3mRNA表达水平与LPS单独刺激组的差异无统计学意义；2.重复上述细胞刺激方案,检测巨噬细胞BAMBI mRNA的表达情况,结果显示,LPS或TGF-β1单独刺激具有抑制BAMBI mRNA表达的作用,联合刺激组BAMBI mRNA的表达水平与单独刺激组无明显差别,加入anti-TGF-β1以后,LPS刺激对BAMBI mRNA的抑制作用于与LPS单独刺激组的差异无统计学意义。结论：1.LPS促巨噬细胞凋亡的作用与刺激巨噬细胞分泌TGF-β1相关,TGF-β1具有促进巨噬细胞凋亡的作用,LPS与TGF-β1联合刺激的促凋亡作用增强；2.TGF-β1具有抑制巨噬细胞TLR4基因及蛋白表达的作用,LPS抑制巨噬细胞TLR4基因及蛋白的表达与促巨噬细胞分泌TGF-β1相关,但并非TGF-β1依赖；3.TGF-β1或LPS单独刺激可抑制巨噬细胞BAMBI基因表达与促进巨噬细胞SOCS3基因表达,但本实验未能证明二者联合刺激对BAMBI及SOCS3基因表达的影响具有协同作用。

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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