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奇异变形杆菌波动生长相关蛋白的筛选与鉴定

作　者: 谢静
导　师: 林於
学　校: 重庆医科大学
专　业: 生药学
关键词: 奇异变形杆菌实时荧光定量PCR 基质辅助飞行时间质谱原子力显微镜扫描
分类号: R378.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

【背景】奇异变形杆菌是一种条件致病菌，但是在过去一个多世纪以来，奇异变形杆菌却以它显著的同心环生长模式和细胞二态性吸引着大量科学家的探索，而目前国内外研究者主要针对单一细菌形态进行某些蛋白表达的研究，探讨的应用也是纯粹的微生物学专业内容的探讨，未见以之作为模型，联系复杂系统探索的工作。本室已历时20年，完成大量的前期工作，包括菌株、pH、琼脂含量、接种方式等对波动生长的影响，本研究拟探索波动过程中基因调控的变化，以奇异变形杆菌形态学研究为基础，将其生长期分为5个阶段，分别提取其蛋白进行筛选及验证，将环境与机制探索结合，为探明波动生长机制奠定一定得基础。【方法】首先在培养基中加入呼吸酶指示剂—2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC)，环上细菌逐渐变为红色，但是这种改变与环的形成不具有同步性，而相对滞后。根据这一现象，将奇异变形杆菌分为5个生长阶段：迁徙阶段、巩固阶段环上及环间细菌、变红阶段环上及环外细菌。分别对其进行结晶紫染色、鞭毛染色、原子力显微镜扫描。得到细菌在各个阶段的菌体形态，鞭毛、表面特征等指标。然后在不同时间及位置小心刮取各生长阶段的细菌，溶菌酶裂解细菌，提取蛋白质，SDS-PAGE分离细菌全蛋白，并用考马斯亮蓝R-250染色。之后筛选出差异条带，酶解，提取肽混合物，进行基质辅助飞行时间质谱检测。最后根据质谱结果，查阅大量文献，筛选出与奇异变形杆菌波动生长机制相关蛋白，查阅编码这些蛋白的基因，提取RNA，实时荧光定量PCR检测其表达量，验证其与波动生长存在相互作用。【结果】培养基中加入TTC后，环上细菌变为红色；随着培养基表面水份的增加，菌落环距减小；迁徙阶段细菌菌体增长，鞭毛增多，巩固阶段菌体开始变短，鞭毛开始脱落；长菌表面粗糙，断裂的短菌表面平整；与细菌运动有关的基因fusA、fliC1在迁徙阶段表达量显著性增高，而tufB表达量显著性降低；与抗氧化应激有关的基因hslO、ahpC在在迁徙阶段表达量显著性增高；与代谢有关的基因icd表达量在迁徙阶段显著性增高，巩固阶段及变红阶段的环上细菌表达量显著性高于环间细菌，pyrC迁徙阶段显著性性增高，flaB变红阶段表达量显著性增高。【结论】1、加入TTC后环上细菌变红，是由细菌在巩固阶段有氧呼吸恢复正常，三羧酸循环的限速酶琥珀酸脱氢酶含量增高，将TTC还原为甲臜而形成红色。2、奇异变形杆菌各生长阶段细菌形态存在显著性差异，且周期性变化。3、奇异变形杆菌各生长阶段的运动及代谢方式存在差异，迁徙阶段细菌运动能力、抗氧化能力增强，呼吸功能、代谢能力降低；巩固阶段细菌繁殖能力、呼吸能力增强。其波动生长机制涉及与运动相关，与代谢相关基因多方面调控。

全文目录

英汉缩略语名词对照  5-7
摘要  7-10
Abstract  10-13
前言  13-17
第一部分奇异变形杆菌不同生长阶段的形态学变化  17-32
  1 材料与方法  17-21
  2 结果  21-28
  3 讨论  28-32
第二部分奇异变形杆菌波动生长相关蛋白筛选与鉴定  32-71
  1 材料与方法  32-43
  2 结果  43-66
  3 讨论  66-71
全文总结  71-72
参考文献  72-78
文献综述  78-87
  参考文献  83-87
致谢  87-88
攻读硕士期间发表的文章  88-89

奇异变形杆菌波动生长相关蛋白的筛选与鉴定

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