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蛋白质赖氨酸的氨基和还原糖的醛基之间发生非酶性糖基化反应,形成Schiff碱,经Amadori反应重排后形成相对稳定的晚期糖基化终产物(advanced glycation end products, AGEs)。在糖尿病血管并发症的发生过程中,AGEs大量堆积是导致糖尿病内皮细胞损伤的重要原因。AGEs可通过介导细胞外相邻的无关蛋白质互相交联等直接效应,改变被修饰蛋白的结构和功能；AGEs也可以与特异的AGEs受体结合影响胞内信号转导、刺激细胞因子释放、引起细胞的氧化应激等,在糖尿病血管并发症中发挥致病效应。真核细胞的内质网是蛋白质折叠与成熟、脂质生物合成以及Ca2+储存的重要场所。生理状态下的蛋白折叠需求增加或出现了打乱蛋白折叠的刺激因素,都可能使内质网功能超负荷运转,从而导致未折叠或错误折叠蛋白蓄积,出现内质网应激(endoplasmic reticulum stress, ER stress).为了防止未折叠或错误折叠蛋白蓄积,真核细胞则引发非折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR),改变细胞的转录和翻译程序,以处理这些蛋白同时改善内质网的应激状态。如果应激时间过长,将不可避免地引起细胞凋亡,这是多种心血管疾病、特别是肥胖和胰岛素抵抗型(2型)糖尿病发病的重要机制。静息状态时,内质网应激的三种感应分子,包括蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、ER转膜蛋白激酶1α (inositol-requiring1α, IRE1α)和转录激活因子6(activating transcription factor6, ATF6),与内质网分子伴侣蛋白—葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)结合处于非激活状态。内质网应激时,GRP78与这些感应分子解离,以处理未折叠或错误折叠的蛋白,而解离后的感应分子则被激活,启动从内质网到细胞核的信号级联放大效应,引发UPR。目的：本研究旨在阐明AGEs是否导致血管内皮细胞的内质网应激,并探讨其介导内质网应激的细胞信号转导机制,特别是氧化应激在其中发挥的作用。方法：本课题以人脐静脉内皮细胞株HUVEC为研究对象,应用细胞培养、蛋白免疫印记、siRNA干扰、细胞免疫荧光等方法,观察AGEs刺激下内质网标志性蛋白表达和磷酸化水平的变化及其介导内皮细胞内质网应激的后果,并从氧化应激角度探讨AGEs介导内质网应激的信号通路机制。AGE修饰的牛血清白蛋白(AGE-modified bovine serum albumin AGE-BSA),由牛血清白蛋白与D-葡萄糖共孵育8周制得。体外培养人脐静脉内皮细胞株HUVEC,接种于3.5cm细胞培养皿上,待细胞长至融合或接近融合时,换无血清培养基继续培养24h,使细胞获得同步生长,然后按实验分组分别处理备用。用蛋白免疫印迹技术检测GRP78的表达和IRE1α的磷酸化水平变化；应用IRE1α siRNA干扰IREα1的表达,用免疫荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察NF-κB在细胞内的分布改变,同时用蛋白免疫印迹技术检测细胞核内NF-κB的表达变化；将脐静脉内皮细胞培养至密度为60-80%,予NADPH氧化酶(Nox)亚型Nox4的siRNA转染细胞48h。另给予活性氧的抑制剂谷胱甘肽(GSH)15mmol/L预处理细胞1h,用蛋白免疫印迹技术检测AGEs刺激后内皮细胞的内质网应激标志性蛋白GRP78的表达和IRE1α的磷酸化水平变化。应用Nox4siRNA干扰Nox4蛋白的表达,用免疫荧光染色法、激光共聚焦显微镜观察NF-κB在细胞内的分布改变。用化学发光法显示蛋白条带,以Image J软件分析各组灰度值。TG作为内质网应激的阳性对照。结果：1. AGE-BSA诱导人脐静脉内皮细胞内质网应激标志性蛋白表达和活性的增高(1) AGE-BSA以时间和剂量依赖的方式引起内皮细胞GRP78表达的增高结果显示,AGE-BSA刺激可引起GRP78表达显著增加,且呈时间(F=46.609,P=0.000)和剂量(F=10.265,P=0.000)依赖性。在时间效应组中,随着AGE-BSA作用时间的延长,细胞中GRP78表达逐渐增高,与对照组相比,从12h起差异有统计学意义(P=0.000),至24h时,到达峰值(P=0.000),随后GRP78蛋白表达开始缓慢下降,当AGE-BSA作用48h时与对照组相比差异仍有统计学意义(P=0.000)。剂量效应组中,随着AGE-BSA浓度从50mg/L逐渐增加到200mg/L,内皮细胞中GRP78表达逐渐增多,当AGE-BSA浓度为50mg/L时,与对照组相比,差异即具有统计学意义(P=0.016)。同样地,内质网应激诱导剂TG也可引起GRP78的表达显著增加。(2) AGE-BSA以时间和剂量依赖的方式引起内皮细胞IREla磷酸化水平的增高结果显示,AGE-BSA刺激可引起IRE1α磷酸化水平显著增加,且呈时间(F=4.220,P=0.004)和剂量(F=5.739,P=0.000)依赖性。在时间效应组中,随着AGE-BSA作用时间的延长,细胞中IRE1α磷酸化水平逐渐增高,与对照组相比,从12h起差异有统计学意义(P=0.025),至48h时,到达峰值(P=0.004)。剂量效应组中,随着AGE-BSA浓度从50mg/L逐渐增加到200mg/L,内皮细胞中IRE1α磷酸化水平逐渐增高,当AGE-BSA浓度为50mg/L时,与对照组相比,差异即具有统计学意义(P=0.031)。同样地,内质网应激诱导剂TG也可引起IRE1α磷酸化水平显著增高。(3) AGE-BSA以时间和剂量依赖的方式引起内皮细胞JNK磷酸化水平的增高结果显示,AGE-BSA刺激可引起JNK磷酸化水平显著增加,且呈时间(F=3.969,P=0.005)和剂量(F=4.244,P=0.002)依赖性。在时间效应组中,随着AGE-BSA作用时间的延长,细胞中JNK磷酸化水平逐渐增高,与对照组相比,从12h起差异有统计学意义(P=0.026),至24h时,到达峰值(P=0.002),随后开始缓慢下降,当AGE-BSA作用48h时与对照组相比差异仍有统计学意义(P=0.005)。在剂量效应组中,随着AGE-BSA浓度从50mg/L逐渐增加到200mg/L,内皮细胞中JNK磷酸化水平逐渐增高,当达到50mg/L时,与对照组相比,差异即具有统计学意义(P=0.011)。2.抑制内质网应激对AGE-BSA诱导NF-κB入核的影响(1) AGE-BSA诱导NF-κB激活入核给予内皮细胞AGE-BSA100mg/L刺激12h,然后进行核质分离,提取核蛋白,采用Western blotting方法检测细胞核NF-κB的表达情况,结果显示,与对照组相比,AGE-BSA刺激组的细胞核NF-κB表达显著增加(P=0.000),结果提示：AGE-BSA诱导脐静脉内皮细胞NF-κB入核。(2)抑制内质网应激对AGE-BSA诱导NF-κB入核的影响转染IRE1α siRNA,成功抑制内质网应激标志性蛋白IRE1α的表达。将脐静脉内皮细胞培养至密度为60～80%,予IRE1α siRNA和control siRNA分别转染细胞48h,提取细胞总蛋白,采用Western blotting方法检测内质网应激标志性蛋白IRE1α的表达,结果显示,与对照组相比,转染IRE1α siRNA组的IRE1α表达明显下降,而control siRNA组的IRE1α表达无明显变化。结果提示,转染IRE1α siRNA,成功抑制了内质网应激标志性蛋白IRE1α的表达。分别预转染IRE1α siRNA和control siRNA,再给予AGE-BSA100mg/L刺激,然后进行核质分离,提取核蛋白,采用Western blotting方法检测细胞核NF-κB的表达情况,结果显示,与单独给予AGE-BSA刺激组相比,预转染IRE1α siRNA组的细胞核NF-κB表达显著下降(P=0.000)。而control siRNA组与AGE-BSA刺激组相比没有显著差异,与IRE1α siRNA组相比,差异具有统计意义(P=0.001)。结果提示：通过抑制IREla表达而抑制内质网应激,可减少AGE-BSA诱导的NF-κB入核。3.形态学观察抑制内质网应激对AGE-BSA诱导NF-κB入核的影响(1) AGE-BSA诱导NF-κB入核给予内皮细胞AGE-BSA100mg/L刺激,然后进行免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察内皮细胞NF-κB的核转位情况。结果显示,与对照组相比,AGE-BSA刺激组的核内NF-κB染色强度明显增加。结果提示：从形态学角度可进一步验证AGE-BSA诱导脐静脉内皮细胞NF-κB入核。(2)抑制内质网应激对AGE-BSA诱导NF-κB入核的影响分别预转染IREla siRNA和control siRNA,再给予AGE-BSA100mg/L刺激,12h后进行免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察内皮细胞NF-κB的核转位情况。结果显示,与单独给予AGE-BSA刺激组相比,预转染IRE1α siRNA组的细胞核内NF-κB染色强度明显减弱。而control siRNA组与AGE-BSA刺激组相比,核内NF-κB染色强度无明显差异。结果提示：从形态学角度可观察到通过抑制IREla表达而抑制内质网应激,可减少AGE-BSA诱导的NF-κB入核。4.氧化应激对AGE-BSA诱导的内质网应激的影响(1)氧化抑制对AGE-BSA诱导的GRP78蛋白表达的影响将脐静脉内皮细胞培养至密度为60-80%,予Nox4siRNA和control siRNA分别转染细胞48h,提取细胞总蛋白,采用Western blotting方法检测Nox4蛋白的表达,结果显示,与对照组相比,转染Nox4siRNA组的Nox4蛋白表达明显下降,而control siRNA组的Nox4表达无明显变化。结果提示,转染Nox4siRNA,成功抑制了氧化剂Nox4蛋白的表达。使用Nox4siRNA下调Nox4的表达以及氧化抑制剂GSH分别预处理细胞后,再给予AGE-BSA100mg/L刺激,12h后提取细胞总蛋白。采用Western blotting方法检测内质网标志性蛋白GRP78的表达变化,结果显示,与单独给予AGE-BSA刺激组相比,预转染Nox4siRNA组(P=0.014)和GSH(P=0.005)预处理组的GRP78蛋白表达显著下降。而control siRNA组与单独给予AGE-BSA刺激组相比,无统计学差异。结果提示：氧化抑制可下调AGE-BSA诱导的GRP78蛋白表达。(2)氧化抑制对AGE-BSA诱导的IREla磷酸化水平的影响使用Nox4siRNA下调Nox4的表达以及氧化抑制剂GSH分别预处理细胞后,再给予AGE-BSA100mg/L刺激,12h后提取细胞总蛋白。采用Western blotting方法检测内质网标志性蛋白IREla磷酸化水平的变化,结果显示,与单独给予AGE-BSA刺激组相比,预转染Nox4siRNA组(P=0.041)和GSH (P=0.001)预处理组的IRE1α磷酸化水平显著下降。而control siRNA组与单独给予AGE-BSA刺激组相比,无统计学差异。结果提示：氧化抑制剂可下调AGE-BSA诱导的IREla磷酸化水平。5.形态学观察抑制氧化应激对AGE-BSA诱导NF-κB入核的影响使用Nox4siRNA下调Nox4的表达以及氧化抑制剂GSH分别预处理细胞后,再给予AGE-BSA100mg/L刺激,12h后进行免疫荧光染色,在激光共聚焦显微镜下观察内皮细胞NF-κB的核转位情况。结果显示,与单独给予AGE-BSA刺激组相比,预转染Nox4siRNA组或GSH预处理组的细胞核内NF-κB染色强度明显减弱。而control siRNA组与AGE-BSA刺激组相比,核内NF-κB染色强度无明显差异。结果提示：从形态学角度可观察到通过抑制Nox4表达或用氧化抑制剂GSH而抑制氧化应激,可减少AGE-BSA诱导的NF-κB入核。结论：1. AGE-BSA以时间和剂量依赖的方式引起内皮细胞内质网应激2.通过下调IRE1α蛋白表达抑制内质网应激,可抑制AGE-BSA诱导的NF-κB激活3. AGE-BSA可通过氧化应激途径诱导内皮细胞内质网应激
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