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AGO2相互作用蛋白PSMC3、DFFA对RNAi功能的影响

作　者: 孔鹏洲
导　师: 汤华
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: RNAi Argonaute2 DFFA PSMC3 荧光共定位 体外剪切
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
下　载: 21次
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内容摘要


目的：RNAi是生物体内基因转录后水平调节的重要方式。外源性的dsRNA.siRNA和内源性的miRNA均可以做作为RNAi的触发器,可以对同源靶RNA诱导产生强大且特异性的剪切或抑制表达作用。RISC作为RNAi的效应器,发挥静默mRNA的作用。人类Argonaute2蛋白是人类Argonaute蛋白家族中已知的唯一在RNAi起作用的成员,是RISC的核心成分之一,与siRNA即可构成最简单的效应器发挥剪切靶mRNA的作用。本实验室在前期工作中利用酵母双杂交系统从人类肺cDNA文库中筛选得到了一系列可能与人类Argonaute2蛋白PIWI(?)吉构域相互作用的蛋白,本文在前期工作的基础上选择了其中两个蛋白DFFA、 PSMC3进行深入研究,对其与Argonaute2蛋白的相互作用进行进一步验证,并研究了这两个蛋白对RNAi的影响,以期进一步深入了解RNAi的机制、探索RNAi可能的调控机制,为RNAi在临床上的应用提供理论依据。方法：选择本实验室在前期工作中利用酵母双杂交系统从人类肺cDNA文库中筛选得到的可能与人类Argonaute2蛋白PIWI结构域相互作用的两个蛋白DFFA、 PSMC3,利用免疫荧光技术,观察DFFA、PSMC3与AGO2蛋白在A549细胞内的共定位。通过分别转染DFFA.PSMC3表达质粒和特异性siRNA干扰DFFA、 PSMC3的表达来研究在活细胞内这两个蛋白对RNAi的影响。通过体外转录生成靶mRNA,利用细胞提取物来实现对靶nRNA的体外剪切,研究在细胞外这两个蛋白对RNAi的影响。结果：1.免疫荧光证明DFFA、PSMC3与内源性、外源性转染的AGO2蛋白共定位于细胞浆中。2. DFFA.PSMC3的过表达在siRNA量为100nM时对RNAi的影响不明显,DFFA、PSMC3的过表达在siRNA量为50nM时对RNAi有促进作用,用特异性siRNA干扰DFFA、PSMC3的表达可以抑制RNAi的效果。3.通过体外剪切靶mRNA,证实了DFFA、PSMC3的过表达对RNAi的影响不明显,特异性siRNA干扰DFFA、PSMC3的表达可以抑制RNAi的效果。结论：免疫荧光技术证实了细胞内DFFA、PSMC3与AG02蛋白存在共同定位,DFFA、PSMC3可以通过与AG02的相互作用影响RNAi、DFFA、PSMC3的过表达在siRNA饱和时对RNAi的影响不明显,DFFA、PSMC3的过表达在siRNA不饱和时可以促进RNAi的效果,DFFA、PSMC3的低表达可以抑制RNAi的效果。DFFA可能作为AG02蛋白的伴侣分子存在,参与AG02蛋白功能的正确发挥。PSMC3作为一种ATPase,兼有解旋酶的活性,则可能在RNAi过程中为siRNA的解旋提供能量,同时作为26S蛋白酶体的一部分,也有可能参与基因翻译起始后抑制。这两个与AG02蛋白相互作用蛋白的发现为RNAi调控机制提出了一种新的可能机制。

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