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土槿皮乙酸诱导小鼠真皮成纤维L929细胞有丝分裂灾变及衰老作用机制研究

作　者: 漆敏
导　师: 池岛乔
学　校: 沈阳药科大学
专　业: 药理学
关键词: 土槿皮乙酸 L929细胞 有丝分裂灾变 衰老 自噬 活性氧 mTOR
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


土槿皮乙酸(Pseudolaric acid B, PAB)是由松科植物金钱松(Pseudolarix Kaempferi Gorden)的干燥根皮或近根树皮提取出的新型二萜酸化合物。现代药理研究表明,土槿皮乙酸具有抗真菌、抗微管、抗肿瘤、抗血管生成、抗生育等多种药理作用,目前土槿皮乙酸已做为抗真菌药物被广泛使用。微管是抗癌药物的重要靶点,以往对土槿皮乙酸的研究表明土槿皮乙酸是一种新型的微管抑制剂,而微管蛋白则是抗肿瘤重要靶点之一,因此土槿皮乙酸有望成为抗肿瘤药物。初步研究结果还发现土槿皮乙酸具有明显的体内外抗肿瘤活性,而且在有效剂量范围内对小鼠骨髓、肝、肾等毒性低。之前的研究发现土槿皮乙酸可通过诱导周期阻滞、凋亡等过程抑制多种肿瘤细胞的增殖。本研究选用小鼠纤维肉瘤L929细胞作为研究对象,考察土槿皮乙酸诱导肿瘤细胞发生有丝分裂灾变、衰老、自噬等程序性死亡过程分子机制,进一步为土槿皮乙酸成为抗肿瘤药物提供理论依据。本研究中,形态学观察结果显示土槿皮乙酸作用L929细胞后,随着给药时间的延长,细胞变圆、变大、变扁平、紧密贴壁。土槿皮乙酸通过抑制微管聚合,破坏微管束状结构、改变细胞骨架、影响纺锤体功能,引起有丝分裂异常。流式细胞术周期分析显示土槿皮乙酸诱导L929细胞出现G2/M期周期阻滞。p-Histone(p-H3)在M期中表达量最高,可以作为M期的标志蛋白。p-H3蛋白水平变化过程和有丝分裂指数分析结果进一步表明土槿皮乙酸诱导L929细胞出现M期阻滞,而非G2期阻滞。进一步研究发现阻滞于M期的细胞因为cyclinBl-cdc2复合物活力的降低发生纺锤体检查点适应,跳出M期进入下一个分裂周期,形成多核细胞。给药时间大于3天后,一部分多核细胞通过凋亡途径死亡。我们还选用了小鼠真皮纤维细胞和人结肠癌HCT116细胞验证了土槿皮乙酸在L929细胞中出现的有丝分裂灾变是否具有普遍性,结果表明土槿皮乙酸诱导肿瘤细胞发生有丝分裂灾变这一现象并非普遍性,而是细胞特异性。上述结果表明土槿皮乙酸诱导L929细胞出现细胞变大、变扁平、紧密贴壁、多核化等衰老细胞的特点。因此,进一步考察有丝分裂灾变细胞的去向显得尤为重要。结果表明药物作用3天后小部分有丝分裂灾变细胞发生凋亡,大部分有丝分裂灾变细胞进入衰老状态。免疫蛋白印迹结果显示土槿皮乙酸通过p19-p53-p21p16-Rb通路诱导L929细胞衰老。研究结果还表明土槿皮乙酸诱导L929细胞产生自噬。进一步研究显示自噬抑制剂3MA和氯喹均能推迟土槿皮乙酸诱导的衰老进程,表明自噬促进衰老过程,其后我们还采用Atg5特异性siRNA验证了该结果。此外,流式细胞术结果显示土槿皮乙酸作用L929细胞后线粒体功能严重受损,包括：细胞胞浆内大量活性氧蓄积,线粒体内超氧阴离子水平增加、线粒体数目增加、呼吸链损伤线粒体比率增加、线粒体ATP生成能力降低。接下来,我们发现土槿皮乙酸在L929细胞中诱导的自噬和活性氧/线粒体损伤相互影响,形成一个正反馈通路,正是该正反馈回路促进衰老的进程。最后,为了检测土槿皮乙酸诱导的衰老细胞可以生存多长时间,延长药物作用时间直至6天,观察形态学变化和周期变化。结果显示土槿皮乙酸作用5天后细胞体积缩小,出现碎片细胞,提示土槿皮乙酸诱导L929细胞形成的衰老细胞持续一定时间后最终走向死亡。另外,本研究中还考察了mTOR在土槿皮乙酸诱导L929细胞死亡过程中的作用。研究结果表明AKT/mTOR通路的失活参与土槿皮乙酸诱导的自噬,而且P53、JNK、ROS三者之间互相促进,形成一个正反馈调节通路。进一步研究表明ROS-JNK-p53通路通过抑制mTOR的活力调控自噬,促进衰老进程。胰岛素、雷帕霉素和TSC2特异性siRNA预处理等方法进一步验证mTOR的失活在土槿皮乙酸诱导L929细胞衰老过程中的作用。此外,我们还选用了MCF-7细胞验证mTOR的失活在土槿皮乙酸诱导的衰老过程中的作用是否具有普遍性。结果表明mTOR的失活也参与土槿皮乙酸诱导的MCF-7细胞衰老过程。

全文目录


摘要  12-14
Abstract  14-16
第一章 绪论  16-47
  第一节 微管蛋白抑制剂的研究进展  16-18
    1. 微管结构  16
    2. 微管功能  16
    3. 微管的聚合和解聚  16-17
    4. 作用于微管的药物  17-18
  第二节 细胞周期的研究进展  18-26
    1. 细胞有丝分裂过程及微管在该过程中的作用  18-19
    2. 细胞周期调控体系  19-20
    3. 细胞周期检验点  20-21
    4. 有丝分裂灾变  21-22
    5. 细胞周期蛋白依赖性激酶  22-24
    6. 细胞周期蛋白  24-25
    7. 细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子  25-26
  第三节 细胞衰老的研究进展  26-31
    1. 细胞衰老类型  27-28
    2. 细胞衰老的特征  28-29
    3. 衰老相关信号通路  29-30
    4. 衰老细胞的作用  30-31
  第四节 mTOR信号通路的研究进展  31-33
    1. PI3K/AKT信号通路  31-32
    2. mTOR信号通路  32
    3. mTORCl下游信号传导途径  32-33
    4. mTOR与肿瘤  33
  第五节 自噬的研究进展  33-38
    1. 自噬的分类  34-35
    2. 自噬的过程  35
    3. 自噬过程的信号调控  35-37
    4. 自噬与衰老的关系  37-38
  第六节 活性氧的研究进展  38-40
    1. 活性氧的生成与清除  38-39
    2. 活性氧与肿瘤  39
    3. 活性氧与自噬  39-40
    4. 活性氧与细胞衰老  40
  第七节 土槿皮乙酸的研究进展  40-42
    1. 抗生育作用  41
    2. 抗真菌作用  41
    3. 抗肿瘤作用  41-42
    4. 抗血管生成作用  42
    5. 抗微管作用  42
  参考文献  42-47
第二章 土槿皮乙酸诱导L929细胞有丝分裂灾变  47-69
  一、实验材料  47-48
  二、实验方法  48-52
  三、实验结果  52-66
    1. 土槿皮乙酸对L929细胞的生长抑制作用  52-53
    2. 土槿皮乙酸诱导L929细胞M期周期阻滞  53-56
    3. 土槿皮乙酸抑制微管聚合干扰纺锤体功能,诱导L929细胞分裂期阻滞  56-57
    4. 土槿皮乙酸诱导L929细胞有丝分裂滑行,形成多核细胞  57-59
    5. cyclinB1-cdc2复合物活力下降促进M期阻滞细胞有丝分裂滑行进入下一个周期  59-61
    6. 土槿皮乙酸诱导的有丝分裂灾变细胞部分通过凋亡途径死亡  61-63
    7. 土槿皮乙酸并非诱导所有肿瘤细胞有丝分裂滑行及后期的洞亡  63-66
  四、讨论  66-67
  五、小结  67
  六、参考文献  67-69
第三章 土槿皮乙酸诱导的自噬通过增强活性氧的产生和线粒体功能紊乱促进细胞衰老  69-95
  一、实验材料  69-70
  二. 实验方法  70-73
  三、实验结果  73-92
    1. 小部分有丝分裂灾变细胞凋亡,大部分有丝分裂灾变细胞进入衰老状态  73-74
    2. 土槿皮乙酸通过p19-p53-p21和p16-Rb通路诱导L929细胞衰老  74-76
    3. 土槿皮乙酸作用L929细胞后自噬先于衰老发生  76-78
    4. 土槿皮乙酸诱导的自噬促进衰老进程  78-81
    5. 土槿皮乙酸诱导L929细胞产生活性氧  81-84
    6. 土槿皮乙酸诱导L929细胞线粒体损伤  84-85
    7. 土槿皮乙酸诱导的活性氧加剧线粒体的损伤,线粒体损伤促进活性氧产生  85-87
    8. 自噬和活性氧/线粒体损伤形成一个正反馈通路  87-89
    9. 活性氧参与土槿皮乙酸诱导的衰老过程  89-90
    10. 土槿皮乙酸诱导L929细胞形成的衰老细胞持续一定时间后最终走向死亡  90-92
  四、讨论  92-93
  五、小结  93
  六、参考文献  93-95
第四章 ROS-JNK-p53通路介导的mTOR抑制在土槿皮乙酸诱导L929细胞发生自噬依赖性衰老进程中发挥重要作用  95-111
  一、实验材料  95-96
  二、实验方法  96
  三、实验结果  96-108
    1. AKT/mTOR通路的失活参与土槿皮乙酸诱导的自噬  97
    2. p53、JNK、ROS形成一个正反馈调节通路  97-100
    3. ROS-JNK-p53通路通过抑制mTOR的活力调控自噬  100-101
    4. ROS-JNK-p53通路调节土槿皮乙酸诱导的衰老过程  101-103
    5. mTOR的激活推迟自噬依赖性衰老进程的发生  103-106
    6. mTOR的失活在土槿皮乙酸诱导MCF-7细胞自噬依赖性衰老中也发挥重要作用  106-108
  四、讨论  108-109
  五、小结  109
  六、参考文献  109-111
缩略语说明  111-113
致谢  113-114
附录  114-117
附件  117-140
学位论文自愿预先检测申请表  140

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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