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温州坛紫菜养殖周期中的藻际微生物多样性

作　者: 沈梅丽
导　师: 杨锐
学　校: 宁波大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 坛紫菜 微生物 多样性 假交替单胞菌 实时荧光定量PCR
分类号: S968.431
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


坛紫菜是我国江浙海区栽培地主要经济藻类。观察紫菜养殖过程中藻际微生物的群落特点及变化，研究藻际环境中的微生物在紫菜栽培中的作用，为保证紫菜健康生长及病害防治提供理论依据与实验基础。采用传统纯培方法和PCR-DGGE分析技术分离归类坛紫菜养殖周期中的藻际微生物，并利用16S rDNA（细菌）和18S rDNA（真菌）序列测定及在线BLAST比对鉴定到属，比较分析不同生长阶段、不同养殖海区及养殖过程的坛紫菜藻际微生物的多样性特点。在坛紫菜养殖过程中总共分离到467株细菌，归属于变形菌门（Alphaproteobacteria和Gammaproteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes），总共41个属，优势菌群为α-变形菌纲和γ-变形菌纲。总共分离到55株真菌，绝大多数真菌菌株属于子囊菌门（Ascomycota），仅一株归属于担子菌门（Basidiomycota）伞菌纲（Agaricomycetes），总共15个属。细菌多样性大于真菌。坛紫菜藻际细菌有19个特异菌属，对照海水细菌有13个特异菌属；从丝状体中分离到大部分真菌和放线菌，坛紫菜养殖丝状体和不同叶状体养殖阶段的藻际微生物类别差异明显。在分离的坛紫菜藻际微生物中发现了与引起坛紫菜细菌性红烂病的海科贝特菌（Cobetia marina）、引起条斑紫菜丝状体白斑病的紫菜茎点菌（Phoma porphyrae）高度相似的菌株，以及与典型的腐霉如镰孢霉菌（Fusarium spp.）和曲霉(Aspergillus spp.)高度相似的菌株。采用实时荧光定量PCR方法检测假交替单胞菌NPyS3和芽孢杆菌WPySW2双菌共培养模型中假交替单胞菌的比例，结合分光光度法和血细胞计数法描绘其生长情况。绘制假交替单胞菌属特异标准曲线：Ct=-3.288×lg(copies)+38.37(R2=0.999)和细菌通用标准曲线：Ct=-3.725×lg(copies)+39.35(R2=0.999)。分光光度法和血细胞计数法测定的生长曲线不完全一致可能由菌体细胞大小差异引起。结合相对定量绘制双菌共培养模型中假交替单胞菌NPyS3和芽孢杆菌WPySW2的生长曲线，发现在16h前WPySW2生长良好，NPyS3生长缓慢，但16h后WPySW2迅速减少而NPyS3快速增多。比较NPyS3和WPySW2在2216E Zobell固体培养基平板上的相互作用，也说明在共培养后期，NPyS3的生长优势大于WPySW2。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
引言  10-12
1 绪论  12-23
  1.1 藻际微生物  12-15
    1.1.1 藻际微环境和藻际微生物  12
    1.1.2 藻类与藻际微生物的相互作用  12-13
    1.1.3 藻际微生物多样性  13-15
  1.2 假交替单胞菌和芽孢杆菌  15-17
    1.2.1 假交替单胞菌的分类地位  15-16
    1.2.2 假交替单胞菌的功能多样性  16-17
    1.2.3 芽孢杆菌的分类地位  17
    1.2.4 芽孢杆菌的功能多样性  17
  1.3 微生物生态研究方法  17-20
    1.3.1 传统方法  17
    1.3.2 DNA 指纹图谱分析  17-19
    1.3.3 基因克隆文库  19-20
    1.3.4 核酸杂交技术  20
  1.4 实时荧光定量 PCR 及其应用  20-22
    1.4.1 实时荧光定量 PCR 原理和特点  20-21
    1.4.2 实时荧光定量 PCR 在微生物研究中的应用  21-22
  1.5 展望  22-23
2 温州坛紫菜细菌的多样性  23-36
  2.1 材料与方法  23-26
    2.1.1 坛紫菜及周边海水样品的采集、细菌的分离纯化  23-24
    2.1.2 细菌的菌落形态观察及镜检  24
    2.1.3 细菌 DNA 的提取  24
    2.1.4 PCR-DGGE 分析  24-26
    2.1.5 16S rDNA 序列分析  26
  2.2 结果  26-33
    2.2.1 坛紫菜细菌形态学分析  26-27
    2.2.2 PCR-DGGE 分析  27-28
    2.2.3 坛紫菜细菌系统发育分析  28-33
  2.3 讨论  33-35
  2.4 小结  35-36
3 温州坛紫菜真菌的多样性  36-45
  3.1 材料与方法  36-38
    3.1.1 坛紫菜及周边海水样品的采集、真菌的分离纯化  36
    3.1.2 真菌的菌落形态观察及镜检  36-37
    3.1.3 真菌 DNA 的提取  37
    3.1.4 PCR-DGGE 分析  37-38
    3.1.5 18S rDNA 序列分析  38
  3.2 结果  38-42
    3.2.1 坛紫菜真菌的分离和形态学分析  38-39
    3.2.2 PCR-DGGE 分析  39-40
    3.2.3 坛紫菜真菌系统发育分析  40-42
  3.3 讨论  42-44
  3.4 小结  44-45
4 实时荧光定量 PCR 检测双菌共培养模型中假交替单胞菌的变化  45-56
  4.1 材料与方法  46-48
    4.1.1 双菌共培养模型菌种的选择  46
    4.1.2 定量 PCR 引物的设计  46
    4.1.3 标准曲线的建立  46-47
    4.1.4 定量 PCR 检测双菌共培养模型中假交替单胞菌的动态变化  47-48
  4.2 结果  48-54
    4.2.1 双菌共培养模型筛选结果  48-50
    4.2.2 标准曲线  50-51
    4.2.3 定量分析双菌共培养模型  51-54
  4.3 讨论  54-55
  4.4 小结  55-56
5 结论  56-58
  5.1 总结  56
  5.2 展望  56-58
参考文献  58-70
附录A 细菌代表性菌株菌落形态图和革兰氏染色图  70-72
附录B 变性梯度凝胶电泳（DGGE）指纹图谱汇总  72-79
附录C 真菌代表性菌株菌落形态和菌丝图片  79-80
在学研究成果  80-81
致谢  81

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产养殖技术 > 各种海产动植物养殖 > 藻类养殖 > 红藻类 > 紫菜
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