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脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）精子和胚胎体外保存的研究

作　者: 浦蕴惠
导　师: 阎斌伦；刘兆普
学　校: 南京农业大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 脊尾白虾精子胚胎体外保存
分类号: S966.12
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

近年来,低温生物学的发展越来越迅速。脊尾白虾作为重要的经济虾之一,在精子和胚胎方面的研究还较少。本论文对脊尾白虾的精子和胚胎体外保存做了相关的研究,为其精子和胚胎的超低温(-196℃)保存筛选了适宜的条件。这些研究为提高脊尾白虾精子超低温冷冻效果提供理论指导,以及为其精子代谢及生理研究提供参考。胚胎的体外保存可以随时为育苗和生产的研究提供材料。以上研究对脊尾白虾种质优选、雌核发育、建立优良种质都具有重要意义。在脊尾白虾精子体外保存的研究中,采用染色法和顶体酶活力两种方法,研究了环境因子对精子活力的影响,当盐度在20-25‰,pH在8.0时,精子的存活率和顶体酶活力较高。在稀释剂和抗冻剂筛选的研究中,稀释剂I-壬氏液为脊尾白虾精子体外保存的最佳稀释剂,4℃下保存4d后,稀释剂I组精子存活率为71.50%,顶体酶活力为1.80μIU/106,两种指标值均高于其他实验组,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性显著y=0.846(p<0.05)；在液氮(-196℃)下保存2d后,稀释剂I组精子存活率达83.50%,顶体酶活力为2.51μIU/106,两种指标值均高于其他各组以及4℃下稀释剂I组同期保存效果,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,γ=0.862(p<0.01)。15%DMSO为脊尾白虾精子超低温保存的最佳抗冻剂,此条件下超低温保存2d后,精子存活率为81.32%,顶体酶活力为1.39gIU/106,各组精子存活率与顶体酶活力之间相关性极显著,相关系数y=0.864(p<0.01)。本文还研究了超低温冷冻保存对脊尾白虾精子内琥珀酸脱氢酶(SDH)、乳酸脱氢酶(LDH)、Na+/K+-ATP酶、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GR)与顶体酶(ACE)活性的影响,以期为提高脊尾白虾精子超低温冷冻效果提供理论依据。设置对照组、3个实验组,于冷冻0、1、3、5、7、15d取样测定各酶活性。结果表明,冷冻后,除GR外,其他所测酶活性均出现显著下降p<0.05),且以对照组酶活性下降幅度最大。GR活性在冷冻7d内显著升高,且对照组明显高于实验组(p<0.05),在冷冻15d时又出现下降。添加15%DMSO组所测酶活性均高于同期其它各组,表明15%DMSO对精子内酶的保护作用较好。从冷冻后各酶下降幅度来看,超低温冷冻对SOD活性的影响最大,其次是Na+/K+-ATP酶。通过单细胞凝胶电泳技术(SCGE)对超低温对精子细胞DNA损伤进行了研究,冷冻后精子DNA受到了不同程度的损伤。鲜精的彗星细胞比例为6.67%,冷冻后,对照组细胞DNA损伤率显著高于实验组(p<0.050.00%。此结果表明在超低温冷冻保存中添加抗冻剂是必要的。15%DMSO抗冻剂下细胞DNA损伤最低,低于其它浓度抗冻剂。该研究为深入研究脊尾白虾精子冷冻损伤提供了科学依据。脊尾白虾胚胎体外保存的研究中,研究得出盐度在20-25‰,pH在7.0时,胚胎的存活率最高。筛选的7种稀释剂中,使用BS2溶液时,胚胎的保存效果较好。选取了DMSO、GLY、1,2-PG作为抗冻剂,发现对胚胎的毒性由大到小依次是1,2-PG、 DMSO、GLY,且浓度5%-10%,存活率升高,10%-20%时,保存效果下降。10%GLY为脊尾白虾超低温保存的最佳抗冻剂,在冷冻10d后的存活率为78.94%。在研究超低温冷冻对脊尾白虾胚胎脂肪酸影响时,发现超低温冷冻保存后各组分发生了明显变化。脊尾白虾胚胎中主要含有29种脂肪酸,碳链长度主要是在C14到C24之间,其中饱和脂肪酸(SFAs)有9种,占37.948%,单不饱和脂肪酸(MUFAs)有8种,占30.091%,多不饱和脂肪酸(PUFAs)有9种,占30.763%。冷冻后,饱和脂肪酸中C15：0和C17：0含量明显下降,对照组与实验组差异显著(p<0.05)。C16：0和C18：0的含量显著上升,对照组与实验组差异显著。单不饱和脂肪酸C16：1超低温冷冻后对照组显著上升,其余实验组显著下降,且与新鲜胚胎、对照组差异性显著(p<0.05)。胚胎冷冻后C18：1n9c(顺)显著上升,各组间差异性显著(p<0.05)。多不饱和脂肪酸C18:2n6c在冷冻后,各组间存在显著差异(p<0.05)。DHA含量在冷冻后显著下降,各组间含量存在显著性差异(p<0.05),EPA在冷冻后含量显著下降。Cn-3/Cn-6呈下降趋势。分析结果发现,添加抗冻剂与未添加抗冻剂各组差异显著。

全文目录

摘要  9-11
ABSTRACT  11-14
缩略语  14-15
第一章综述  15-27
  1 甲壳动物精子的低温保存  15-19
    1.1 甲壳动物精子的采集  16-17
    1.2 稀释剂和抗冻剂  17-18
    1.3 精子的冷冻方法  18
    1.4 精子的解冻  18-19
    1.5 精子的活力评价方法  19
  2 甲壳动物胚胎的低温保存  19-20
  3 展望  20-23
    3.1 精子活力的评价方法  20
    3.2 经济甲壳动物精子的低温保存技术的拓展与完善  20
    3.3 冷冻损伤  20-21
    3.4 壳动物卵子、胚胎及幼虫的低温保存  21-23
  参考文献  23-27
第二章脊尾白虾精子体外保存的研究  27-61
  引言  27
  1 环境因子对尾白虾精子存活率的影响  27-32
    1.1 材料、试剂、仪器  27-28
      1.1.1 脊尾白虾来源及精子的采集  27-28
      1.1.2 主要试剂  28
      1.1.3 主要仪器  28
    1.2 方法  28-29
      1.2.1 环境因子对精子存活率的影响(pH、盐度)  28
      1.2.2 精子存活率的检测方法  28-29
      1.2.3 精子顶体酶活力的测定方法  29
    1.3 结果  29-32
    1.4 讨论  32
  2 脊尾白虾精子的体外保存的研究  32-41
    2.1 材料  32-33
      2.1.1 脊尾白虾来源及精子的采集  32
      2.1.2 主要试剂  32-33
      2.1.3 主要仪器  33
    2.2 方法  33-34
      2.2.1 不同稀释剂对精子低温保存的影响  33
      2.2.2 不同稀释剂对精子超低温保存的影响  33
      2.2.3 不同抗冻剂对精子超低温保存的影响  33-34
      2.2.4 精子存活率的检测方法  34
      2.2.5 数据处理  34
    2.3 结果  34-40
      2.3.1 不同稀释剂对精子低温保存的影响  34-36
      2.3.2 稀释剂对精子超低温保存的影响  36-37
      2.3.3 抗冻剂对精子超低温保存的影响  37-40
    2.4 讨论  40-41
      2.4.1 精子保存质量的评价方法  40
      2.4.2 稀释剂对精子低温保存效果的影响  40-41
      2.4.3 抗冻保护剂对精子保存效果的影响  41
  3 超低温冷冻对脊尾白虾精子酶活性的影响  41-49
    3.1 材料与方法  41-42
      3.1.1 样品制备  41-42
      3.1.2 精子的冻存与复苏  42
      3.1.3 酶活性检测方法  42
      3.1.4 数据处理  42
    3.2 结果  42-47
      3.2.1 超低温冷冻对SDH、LDH和Na~+/K~+-ATP酶活性的影响  42-44
      3.2.2 超低温冷冻对SOD、CAT和GR活性的影响  44-46
      3.2.3 超低温冷冻对ACE活性的影响  46-47
    3.3 讨论  47-49
      3.3.1 超低温冷冻对脊尾白虾精子能量代谢酶活性的影响  47-48
      3.3.2 超低温冷冻对脊尾白虾精子抗氧化酶活性的影响  48
      3.3.3 超低温冷冻对脊尾白虾顶体酶活性的影响  48-49
      3.3.4 超低温冷冻保存对脊尾白虾精子的损伤  49
  4 超低温冷冻对脊尾白虾精子损伤的研究  49-53
    4.1 材料  49-50
    4.2 主要试剂  50
    4.3 主要仪器  50
    4.4 方法  50-51
      4.4.1 冷冻试验  50
      4.4.2 单细胞凝胶电泳  50-51
    4.5 数据处理  51
    4.6 结果  51
    4.7 讨论  51-53
  5 本章小结  53-55
  参考文献  55-61
第三章脊尾白虾胚胎体外保存的研究  61-77
  引言  61
  1 环境因子对脊尾白虾胚胎的影响  61-64
    1.1 材料  61-62
      1.1.1 脊尾白虾来源及胚胎的采集  61-62
    1.2 方法  62
      1.2.1 环境因子对胚胎存活率的影响(pH、盐度)  62
      1.2.2 存活率的检测方法  62
      1.2.3 数据处理  62
    1.3 结果  62-64
    1.4 讨论  64
  2 脊尾白虾胚胎体外保存的研究  64-69
    2.1 材料  64-65
      2.1.1 脊尾白虾来源及胚胎的采集  64
      2.1.2 稀释剂成分见表3-3  64-65
    2.2 方法  65-66
      2.2.1 不同稀释剂对脊尾白虾胚胎超低温保存的影响  65
      2.2.2 不同抗冻剂对脊尾白虾胚胎超低温保存的影响  65
      2.2.3 胚胎的冷冻与复苏  65-66
      2.2.4 存活率的检测方法  66
    2.3 结果  66-68
    2.4 讨论  68-69
      2.4.1 胚胎保存效果的评价方法  68
      2.4.2 稀释剂对精子低温保存效果的影响  68
      2.4.3 抗冻剂对胚胎超低温保存效果的影响  68-69
  3 超温保存对脊尾白虾胚胎脂肪酸的影响  69-75
    3.1 材料与试剂  69
      3.1.1 脊尾白虾来源及胚胎的采集  69
      3.1.2 试剂  69
    3.2 方法  69-70
      3.2.1 冷冻实验方法  69
      3.2.2 脂肪酸样品的制备  69-70
      3.2.3 气相色谱条件  70
      3.2.4 数据分析  70
    3.3 主要仪器  70
    3.4 结果  70-72
    3.5 讨论  72-75
  4 本章小结  75-77
参考文献  77-79
全文总结  79-81
创新点  81-83
附图  83-87
硕士期间发表及撰写的论文  87-89
致谢  89

脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda）精子和胚胎体外保存的研究

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