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胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因在仿刺参再生过程中的表达分析

作　者: 袁哲
导　师: 侯林
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 海洋生物学
关键词: 仿刺参胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因表达模式组织再生器官再生
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在动物的许多生理过程中起着十分重要的作用,包括创伤修复,炎症反应,凝血反应,再生等功能。本文通过基因克隆(RACE)技术首次获得了仿刺参胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶的全长cDNA序列,该序列含有1216bp碱基对,5’端有39bp的非编码区,3’端有355bp的非编码区。通过基因步移的实验手段得到了胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因包括内含子和外显子在内的DNA序列,该序列包括含有4个内含子序列和5个外显子序列。用原位杂交技术来检测胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在不同组织中的表达,结果显示胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶在体壁,肠,呼吸树等组织中均有分布,其中在肠中的信号最强。用Realtime-PCR技术分别检测胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因在不同组织的不同再生阶段的表达模式。结果显示在再生一小时内的体壁中,胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因呈现出短暂并明显的上调趋势,接着表达量下调,随着组织的再生,胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因表达量上调,最后达到正常水平。在肠和呼吸树中,胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的表达量随着组织的再生呈现出上升趋势。但是在这些组织中胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因的表达量一直低于正常水平直到再生出新组织表达量恢复到正常水平。胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因在仿刺参不同再生阶段的表达量的变化表明其在再生过程中起着重要的作用。对仿刺参胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因在其不同再生过程中表达模式的研究对于阐明仿刺参再生调控通路和相关分子机制的有着重要意义。同时,对于进一步了解仿刺参苗种生产和养殖过程中吐肠的发生和防治及提高苗种成活率有着一定的应用价值。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-6
缩略词表  6-7
目录  7-10
第1章前言  10-23
  1.1 动物的再生  10-12
  1.2 海参的再生  12-20
    1.2.1 枝手目海参的再生模式  12-13
    1.2.2 盾手目海参的再生模式  13
    1.2.3 无足目海参的再生模式  13
    1.2.4 海参吐脏再生  13-17
    1.2.5 海参体壁的再生  17
    1.2.6 海参肌肉的再生  17-19
    1.2.7 海参幼体的再生  19
    1.2.8 海参再生分子机制的研究  19-20
  1.3 丝氨酸蛋白酶  20-21
    1.3.1 胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶  20-21
  1.4 本研究的目的和意义  21-23
第2章仿刺参TLS基因全长和内含子序列的克隆及序列分析  23-41
  2.1 前言  23
  2.2 材料与方法  23-30
    2.2.1 样品处理  23
    2.2.2 载体和菌株  23
    2.2.3 实验仪器和设备  23-24
    2.2.4 总RNA提取试剂及器具  24
    2.2.5 反转录和PCR相关试剂  24
    2.2.6 胶及质粒回收试剂  24
    2.2.7 琼脂糖凝胶电泳试剂  24-25
    2.2.8 培养基的配制  25
    2.2.9 总RNA的提取  25
    2.2.10 RT-PCR  25-26
    2.2.11 TLS基因全长的获得  26
    2.2.12 TLS基因内含子序列的获得  26-29
    2.2.13 生物信息学分析  29-30
  2.3 结果  30-39
    2.3.1 TLS基因全长  30-31
    2.3.2 TLS基因内含子序列  31-32
    2.3.3 生物信息学分析  32-37
    2.3.4 仿刺参TLS蛋白进化分析  37-39
  2.4 讨论  39-40
  2.5 小结  40-41
第3章仿刺参TLS基因在成体组织器官中的表达部位  41-51
  3.1 前言  41
  3.2 材料与方法  41-48
    3.2.1 组织材料  41
    3.2.2 原位杂交药品配制及试剂盒  41-44
    3.2.3 实验仪器  44
    3.2.4 合成探针的引物  44
    3.2.5 RNA原位杂交的原理  44
    3.2.6 仿刺参组织固定  44
    3.2.7 组织脱水  44-45
    3.2.8 组织透明  45
    3.2.9 组织浸蜡包埋  45
    3.2.10 切片、展片及烘片  45-46
    3.2.11 探针合成  46-47
    3.2.12 石蜡切片原位杂交的过程  47-48
  3.3 结果  48-50
  3.4 讨论  50
  3.5 小结  50-51
第4章仿刺参TLS基因在不同组织的不同再生阶段的表达模式  51-61
  4.1 前言  51
  4.2 材料与方法  51-54
    4.2.1 材料处理  51-52
    4.2.2 相关试剂  52
    4.2.3 实验仪器和器材  52
    4.2.4 引物  52
    4.2.5 不同发育阶段组织的处理  52
    4.2.6 总RNA中基因组DNA的去除  52-53
    4.2.7 反转录反应  53
    4.2.8 Real Time PCR反应  53-54
    4.2.9 Real Time PCR数据的处理  54
  4.3 结果  54-59
    4.3.1 仿刺参肠再生情况的观察  54-56
    4.3.2 仿刺参TLS基因在不同再生时期的表达模式  56-59
  4.4 讨论  59-60
  4.5 小结  60-61
参考文献  61-69
攻读硕士学位期间发表学术论文情况  69-70
致谢  70

胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因在仿刺参再生过程中的表达分析

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