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牛虻和家蝇螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索

作　者: 俞徐斌
导　师: 于汉寿
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 牛虻 螺原体 生物学特性 生物信息学 致病相关因子 克隆表达
分类号: S895
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


螺原体(spiroplasma)是一类无细胞壁、形态呈螺旋状的原核生物,以昆虫和植物为主要宿主,大多数与宿主互生,少数对动植物具有致病性。国外研究人员从虻蝇类昆虫体内分离到大量的螺原体,这类昆虫体内具有丰富的螺原体资源。而国内有关昆虫螺原体的研究很少。本研究的目标首先是调查我国虻蝇类昆虫体内螺原体的存在情况,初步了解螺原体的生物多样性和地理多样性。此外,螺原体引起的蜜蜂爬蜂病在我国发生普遍,其次是在测定蜜蜂螺原体Spiroplasma melliferum CH-1基因组序列的基础上,选择蜜蜂螺原体致病过程中可能涉及的一些致病相关因子,应用生物信息学方法进行分析,并研究部分潜在致病相关基因的体外表达,为今后深入研究蜜蜂螺原体的致病机理奠定基础。主要研究结果有：第一,从江苏南京、浙江永康、广西桂林三地采集的110只牛虻和40只苍蝇样品中分离得到大量螺原体菌株。对其中分离自嗜牛原虻(Tabanus bovinus)的16株螺原体和分离自家蝇(Msuca domestica)的1株螺原体DCY1207-1的基本生物学特性进行了研究。17株螺原体在形态学,生理生化特性上基本一致。在对数生长期呈典型的螺旋状,呈翻滚式运动,菌体能通过孔径为0.22μm以及0.45μm的微孔滤膜,在固体培养基上的菌落呈颗粒状或者不规则状,生长的pH范围在5.2-10.2之间,最适pH在7.3左右;它们都能代谢葡萄糖和D-果糖,除NM1108-5、NM1208-5、NM1208-63株菌外其他菌株均能利用甘露醇；分离菌株均不能代谢精氨酸和尿素,生长速度较快,大约在18h就能达到对数生长期。单向血清学试验结果表明,牛虻螺原体与蜜蜂螺原体S. melliferum CH-1、引起乳鼠白内障的S. mirum及中华绒螯蟹颤抖病的S.eriocheiris的亲缘关系较远。第二,采用改良过的CTAB/NaCl法提取螺原体基因组,扩增16SrDNA序列。根据16S rDNA序列构建系统发育树,所有分离菌株分为2个进化支,分别为Apis和Citri-Chrysopicola-Mirum。大多虻蝇类昆虫螺原体菌株与S. turonicum聚类,且自展值接近100%;而NM1108-5,NM1208-6与S. gladiatoris聚类,NM1208-5与S. syrphidicola聚类。进一步利用转录间隔区序列(ITS)以及编码RNA聚合酶p亚基的基因(rpoB)作为基因Marker,进行系统发育学分析,验证了16S rDNA的分析结果,并能有效地区分不同虻蝇类螺原体菌株。根据分离菌株的生物学特性、部分血清学特性和系统发育学分析,将分离自牛虻的菌株NM1108-5、NM1208-6初步鉴定为S. gladiatoris,NM1208-5为S. syrphidicola.分离自家蝇的DCY1207-1和分离自牛虻的其他菌株NM1108-1等均初步鉴定为S. turonicum。第三,在测定了蜜蜂螺原体CH-1基因组序列的基础上,对蜜蜂螺原体所特有的几丁质酶基因进行生物信息学分析,结果表明：(a)不同细菌几丁质酶的氨基酸序列长度大小及其理化性质虽存在一定差异,但都含有5个保守氨基酸片段,分别是LGGAD, DIDLEQ, MAPEPYL, DAAA, MTWS。(b)螺原体几丁质酶无跨膜结构域,但有一个与Glycosyl hydrolases family18相匹配的功能结构域,具有降解碳水化合物的功能；其二级结构是以卷曲和α-螺旋为主要的结构元件,p-折叠和p-转角散布于整个结构,其目标蛋白序列与模型序列的相似度达到46.72%,可认为目标蛋白的三维结构与模型三维结构基本相似。(c)依据几丁质酶氨基酸序列构建的进化树分析,不同细菌几丁质酶的进化关系上可分为四大支；蜜蜂螺原体几丁质酶与其他细菌几丁质酶的亲缘关系较远。第四,经生物信息学分析,几丁质酶基因、几丁质脱乙酰基酶基因和P54蛋白基因是蜜蜂螺原体中3个可能与致病相关的基因。本研究成功克隆出这3个基因的全长,并在大肠杆菌中完整表达了几丁质脱乙酰基酶基因和P54蛋白基因,部分表达了几丁质酶基因,进一步证实螺原体CH-1中的TGA编码色氨酸而非终止密码子。本研究结果为今后进一步确定这些基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。

全文目录


目录  5-8
摘要  8-10
ABSTRACT  10-13
文献综述  13-35
  一、虻蝇类昆虫螺原体的研究概况  13-17
    1. 螺原体的基本生物学特征  13
    2. 虻科和蝇科类昆虫简介  13-14
    3. 虻蝇类昆虫螺原体与宿主的关系  14
    4. 虻蝇类昆虫螺原体的生物多样性与地理位置的关系  14-17
  二、螺原体致病相关因子研究进展  17-25
    1. 动植物中主要致病性螺原体  17-18
    2. 螺原体主要致病相关因子  18-25
      2.1 黏附相关膜蛋白(adhesion-related protein)  19-21
      2.2 几丁质酶和几丁质脱乙酰基酶  21-23
      2.3 其他潜在致病相关因子  23-25
  三、本研究的主要内容、目的和意义  25-26
  参考文献  26-35
第一章 牛虻和家蝇螺原体的生物学特性  35-65
  摘要  35
  前言  35-36
  1 材料与方法  36-42
    1.1 牛虻和家蝇样品的采集、保存及鉴定  36-37
    1.2 螺原体的分离、纯化及保存  37-38
      1.2.1 R2及BSM培养基的配制  37
      1.2.2 螺原体的分离、纯化及保存  37-38
    1.3 螺原体形态,运动性,滤过性研究  38
      1.3.1 暗视野显微镜及透射电镜下观察菌体的形态和运动性  38
      1.3.2 固体菌落形态特征观察及螺原体滤过性研究  38
    1.4 螺原体生长特性的研究  38-40
      1.4.1 螺原体生长曲线的测定  38
      1.4.2 透射电镜下观察不同生长时期的螺原体形态以及其繁殖方式  38-39
      1.4.3 pH对螺原体生长的影响  39
      1.4.4 螺原体对血清的需求  39
      1.4.5 螺原体对碳水化合物的利用  39
      1.4.6 不同蔗糖浓度对螺原体生长的影响  39
      1.4.7 螺原体对精氨酸和尿素的利用  39-40
      1.4.8 螺原体对抗生素的敏感试验  40
    1.5 暗视野显微镜下螺原体点状的观察  40
    1.6 螺原体单向血清学分析  40-41
      1.6.1 生长抑制试验  40
      1.6.2 代谢抑制试验  40-41
    1.7 螺原体系统发育学分析  41-42
      1.7.1 螺原体基因组的提取方法  41
      1.7.2 目的片段的扩增与电泳检测  41-42
      1.7.3 目的片段测序  42
      1.7.4 系统发育分析  42
  2 结果与分析  42-58
    2.1 昆虫的采集、保存及鉴定  42-43
    2.2 螺原体的分离、纯化及保存  43-44
    2.3 螺原体形态、运动性、滤过性研究  44-45
    2.4 螺原体分离菌株的生长特性  45-49
    2.5 暗视野显微镜下螺原体点状观察  49-50
    2.6 螺原体单向血清学分析  50-52
    2.7 螺原体系统发育学分析  52-58
  3. 小结与讨论  58-61
  参考文献  61-65
第二章 蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析与克隆表达  65-87
  第一节 蜜蜂螺原体儿丁质酶序列生物信息学分析  65-74
    摘要  65
    前言  65-67
    1 材料与方法  67-68
      1.1 材料  67
      1.2 方法  67-68
    2 结果与分析  68-74
      2.1 儿丁质酶氨基酸序列的结构及其编码氨基酸序列的理化性质  68-69
      2.2 几丁质酶氨基酸序列与其他细菌的相似性比较  69-70
      2.3 螺原体几丁质酶的疏水性/亲水性、跨膜结构域、信号肽、功能域预测  70-71
      2.4 螺原体CH-1几丁质酶的二级结构和三级结构特征  71-72
      2.5 螺原体CH-1几丁质酶氨基酸序列分子系统进化特征  72-74
  第二节 蜜蜂螺原体潜在致病相关基因的克隆与表达  74-84
    摘要  74
    前言  74-75
    1 材料与方法  75-78
      1.1 供试菌株与试剂  75-76
      1.2 方法  76-78
    2. 结果与分析  78-82
    3. 小结与讨论  82-84
  参考文献  84-87
全文总结  87-91
附录：部分牛虻螺原体菌株16S RDNA,ITS及RPOB序列BLAST搜索结果  91-97
攻读硕士期间发表的学术论文  97-99
致谢  99

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 养蜂、益虫饲养 > 病虫害防治
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