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Reversine对梅花鹿成纤维细胞及其异种核移植胚胎重编程能力的影响

作　者: 姚雅馨
导　师: 李和平
学　校: 东北林业大学
专　业: 野生动植物保护与利用
关键词: Reversine 梅花鹿重编程成纤维细胞牛-鹿异种核移植
分类号: S825
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

我国的野生梅花鹿数量十分稀少,早在1978年就被列为我国的国家Ⅰ级重点保护野生动物,中国濒危动物红皮书也将其列为濒危(Endangered)等级。当人类对于这样的珍稀物种,如果在其濒危灭绝甚至灭绝之前,未曾利用任何方式将其种质资源保存下来的话,那么当它一旦遭遇灭绝,就意味着野生梅花鹿的整个细胞生物学和分子生物学以及对其可能展开研究的基本材料就会永远丧失。因此,如果能够将濒危动物的遗传资源以体细胞库的形式保存下来,并找到适合的技术手段将体细胞的多潜能性挖掘出来,那么使之再现的愿望将逐步得以实现。由于从克隆青蛙到诱导多能干(iPS)细胞,科研工作者一直在为解决细胞重编程中的安全问题和效率问题进行不屑的努力,希望通过添加小分子化合物这一安全而直接的方式使体细胞完成重编程过程,Reversine是一种小分子化合物,利用它处理成体细胞后能够明显将其转变为一种与干细胞类似的“原始状态”,这种经过处理的细胞具备了分化的潜能性,并且能够提高核移植胚胎的发育水平。因此,本研究以梅花鹿的耳缘组织为研究材料,利用组织块贴壁法培养原代梅花鹿细胞并成功建立起该组织的成纤维细胞系,利用胰酶消化法对其进行传代,并根据细胞的生长状态绘制细胞生长曲线；当细胞生长至100%接触抑制时,对其进行冻存,并统计冻存细胞的样本含量；后进行复苏,检测复苏前后的细胞活力；利用吉姆萨染色法对梅花鹿成纤维细胞的核型进行分析。结果显示,利用组织块贴壁法能够培养出梅花鹿的原代细胞并成功建立起该组织的成纤维细胞系,细胞样本含量为137,其中每份细胞数量为(1-3)×106个/ml；核型分析后确定该样本来源于东北梅花鹿,染色体数目为2n=66。在梅花鹿成纤维细胞库构建成功后,本研究开始着眼于挖掘体细胞的多潜能性上首先利用5μM的reversine处理复苏后48小时的梅花鹿成纤维细胞4d,观察处理前后的细胞形态变化,并利用流式细胞仪检测细胞周期的分布情况和凋亡现象,之后利用间接免疫荧光法检测reversine处理前后细胞的增殖情况和细胞骨架的变化趋势；为了体现reversine具有使成体细胞去分化的能力,本研究将处理后的成纤维细胞分别向成骨、成脂和成肝样细胞进行定向诱导分化；后利用共聚焦显微技术定性,流式细胞检测技术定量分析了诱发细胞去分化潜能的组蛋白修饰情况。结果显示,经reversine处理的细胞的BrdU的表达量明显降低,细胞处于分裂期的数量明显降低。说明经过reversine处理的细胞增殖能力降低并获得了多核细胞；经过定向诱导分化,成功将经过reversine处理后的细胞诱导分化成为成骨、成脂和成肝样细胞,通过了免疫组织化学和RT-PCR的检测,证明了诱导的成功；共聚焦的定性和流式细胞仪的定量检测后发现,经过reversine处理后的成纤维细胞乙酰化水平明显升高,而甲基化和磷酸化水平均有一定程度的降低,这在表观遗传修饰水平上证明了reversine能够通过重编程使梅花鹿的成纤维细胞获得去分化的能力。能够使濒危灭绝动物复原的有效手段当属构建异种核移植胚胎,本研究以梅花鹿的成纤维细胞作为供体细胞,以成熟的牛MⅡ期卵母细胞作为核受体进行异种核移植,比较异种核移植、同种核移植与体外受精胚胎的发育水平,并利用reversine处理核移植胚胎,以期能够达到提高重构胚发育水平的目的,并利用间接免疫荧光法检测连接组蛋白H1的表达特点。结果显示,在本研究中成功构建了牛-鹿异种核移植胚胎,并经过培养获得了异种核移植胚胎的囊胚,对其发育水平进行比较后发现牛-鹿异种核移植胚胎的发育时间并没有滞后于牛-牛同种核移植胚胎,但是发育到囊胚期的效率却明显低于同种核移植胚胎(16±8.8%vs7士3.9%,P<0.05),而经过reversine处理的牛-牛同种核移植胚胎与牛-鹿异种核移植胚胎的发育水平都有明显的提高(16±8.8%vs28.2±5.9%,P<0.05；3.7±3.9%vs16.1±5.3,P<0.05)；并且通过间接免疫荧光法检测到在卵母细胞中特异表达的连接性组蛋白H1foo与体细胞类型H1组蛋白之间存在着一种此消彼长的变化趋势,正常受精胚胎的卵母细胞特异性的连接组蛋白H1Foo与体细胞类型连接组蛋白H1的角色转换发生在16-细胞期甚至更晚,而同种核移植胚胎在2-细胞期的时候就要进行这样的转换,这从连接组蛋白的角度上解释了核移植胚胎的重编程过程不完整的原因。而经过Reversine的处理后,核移植胚胎的连接组蛋白的表达模式得到了一定程度的纠正,其表达模式与体外受精胚胎的表达模式较为接近,这种组蛋白表达模式的纠正解释了经过reversine处理的异种核移植胚胎发育水平明显升高的原因。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-14
1 绪论  14-35
  1.1 梅花鹿的濒危现状  14-16
    1.1.1 野生梅花鹿的现存状况  14-15
    1.1.2 野生梅花鹿的濒危原因  15-16
  1.2 野生动物体细胞库的建立  16-18
    1.2.1 动物资源保存的方法  16
    1.2.2 建立野生动物体细胞库的必要性  16-17
    1.2.3 动物细胞培养的发展简史  17
    1.2.4 动物细胞系的建立  17-18
  1.3 提高体细胞全能性的方法与手段  18-23
    1.3.1 化合物的添加  19
    1.3.2 蛋白因子的添加  19-20
    1.3.3 基因的阻断和介入  20
    1.3.4 诱导细胞系的选择  20-22
    1.3.5 培养条件的优化  22-23
    1.3.6 基因替代性小分子化合物的添加  23
  1.4 Reversine的去分化作用原理及其应用前景  23-26
    1.4.1 经Reversine处理的成体细胞向不同胚层方向的分化及原理  23-25
    1.4.2 Reversine的目的作用蛋白  25-26
    1.4.3 Reversine对核移植胚胎的影响及面临的问题  26
  1.5 异种核移植  26-35
    1.5.1 异种核移植的概念  27
    1.5.2 异种细胞核移植技术研究历史和现状  27-29
    1.5.3 异种细胞核移植的意义  29
    1.5.4 异种核移植存在的问题以及可能的解决方法  29-31
    1.5.5 提高异种核移植胚胎重编程能力的方法  31-35
2 东北梅花鹿成纤维细胞库的构建  35-42
  2.1 前言  35
  2.2 材料  35-36
    2.2.1 实验动物来源  35
    2.2.2 实验用仪器设备  35-36
    2.2.3 主要实验试剂  36
    2.2.4 主要溶液的配置方法  36
  2.3 方法  36-38
    2.3.1 细胞原代培养  36-38
  2.4 结果  38-40
    2.4.1 梅花鹿原代细胞培养及形态学观察  38-39
    2.4.2 细胞活率计算  39
    2.4.3 细胞生长的动态观察  39
    2.4.4 核型分析  39-40
    2.4.5 梅花鹿的染色体测量参数  40
  2.5 讨论  40-41
    2.5.1 细胞纯化  40-41
    2.5.2 无菌环境对细胞培养的重要性  41
  2.6 小结  41-42
3 Reversine对梅花鹿成纤维细胞重编程能力的影响  42-63
  3.1 前言  42
  3.2 材料  42-44
    3.2.1 实验材料  42
    3.2.2 实验仪器  42
    3.2.3 主要实验试剂  42
    3.2.4 主要实验试剂的配置  42-44
  3.3 实验方法  44-49
    3.3.1 Reversine处理梅花鹿成纤维细胞  44
    3.3.2 细胞周期检测  44
    3.3.3 细胞凋亡检测  44
    3.3.4 间接免疫荧光法  44-45
    3.3.5 RT-PCR检测  45-48
    3.3.6 向成骨细胞诱导分化及鉴定  48
    3.3.7 向脂肪细胞诱导分化  48-49
    3.3.8 向肝样细胞诱导分化  49
  3.4 结果  49-60
    3.4.1 Reversine对细胞形态,周期及活力的影响  49-51
    3.4.2 Reversine对细胞增殖能力的影响  51
    3.4.3 Reversine对细胞骨架的影响  51-53
    3.4.4 Reversine对细胞分化多潜能性的影响  53-58
    3.4.5 Reversine对细胞组蛋白修饰水平的影响  58-60
  3.5 讨论  60-61
    3.5.1 Reversine对细胞生长和增殖的特点  60
    3.5.2 诱导分化  60-61
    3.5.3 表观遗传修饰水平对细胞重编程能力的影响  61
  3.6 小结  61-63
4 Reversine对梅花鹿异种核移植胚胎重编程能力的影响  63-79
  4.1 前言  63
  4.2 材料  63
  4.3 主要实验仪器  63-66
    4.3.1 主要实验试剂  64-65
    4.3.2 主要溶液的配制  65-66
  4.4 方法  66-67
    4.4.1 卵母细胞采集与体外成熟  66
    4.4.2 供体细胞的准备  66
    4.4.3 异种核移植  66
    4.4.4 Reversine处理核移植胚胎  66
    4.4.5 重构胚的激活与培养  66-67
    4.4.6 异种重构胚的间接免疫荧光检测  67
    4.4.7 异种重构胚染色体分析  67
  4.5 结果  67-76
    4.5.1 牛卵母细胞体外成熟及异种核移植胚胎发育  67-69
    4.5.2 Reversine对牛-鹿异种核移植胚胎发育水平的影响  69
    4.5.3 异构胚染色体分析  69-70
    4.5.4 Reversine对核移植胚胎连接组蛋白的影响  70-76
  4.6 讨论  76-77
    4.6.1 牛-鹿异种核移植胚胎的发育水平  76
    4.6.2 异构胚遗传物质的鉴定  76-77
    4.6.3 Reversine对核移植胚胎连接组蛋白表达模式的影响  77
  4.7 小结  77-79
结论  79-81
参考文献  81-94
攻读学位期间发表的学术论文  94-95
致谢  95-96

Reversine对梅花鹿成纤维细胞及其异种核移植胚胎重编程能力的影响

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