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精子预处理和母牛热应激对牛单性生殖胚胎发育的影响

作　者: 肖遥
导　师: 杨利国
学　校: 华中农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: 精子获能 顶体 溶血卵磷脂 温湿指数 甜菜碱
分类号: S823
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


胚胎体外生产技术是充分利用雌性动物繁殖性能、加快遗传育种改良、生产转基因动物和研究胚胎早期发育机制的重要手段,主要包括体外受精(IVF)、精子卵胞质内注射(ICSI)、体细胞核移植以及单性生殖,即孤雌和孤雄生殖。单性生殖胚胎仅含有母源或父源遗传物质,已在模式动物中用来研究基因组印记的发育调控机制、建立单性生殖胚胎干细胞系和生产基因修饰动物。家畜孤雄生殖胚胎研究起步晚、生产过程复杂且效率低,已严重阻碍其作用的发挥。家畜精子在卵胞质内解聚能力较差可能是影响孤雄生殖胚胎发育的关键原因之一。精子获能、顶体反应和精卵质膜融合是自然受精前精子所经历的主要生理变化。因此,精子注射前进行体外获能、去除顶体和质膜的预处理以模拟这些变化,可能会增强精子解聚能力从而提高牛孤雄生殖胚胎发育潜能。夏季高温危害母牛体内卵母细胞发育,从而降低奶牛繁殖性能,并减弱卵母细胞及其WF胚胎发育能力。因此,母牛热应激也可能对单性生殖胚胎发育造成影响。另外,此前研究多用季节反映母牛热应激对卵母细胞质量的影响,并不能确切、定量地描述环境热应激对卵母细胞发育的损害。温湿指数(THI)作为衡量热应激程度的环境指标已用于检测热应激对奶牛产奶量和受胎率的影响。因此,用卵母细胞供体母牛所处环境的THI与卵母细胞质量和后期发育联系起来,其结果更具可比性和参照性。据报道甜菜碱能帮助微生物、植物和家禽抵抗热应激,尚不清楚甜菜碱对哺乳动物及其细胞的影响。为利用甜菜碱降低母牛热应激对卵母细胞质量和发育能力的负面影响,须先在牛体外细胞模型中鉴定其抗热应激功能。围绕上述问题,本文做了以下四个方面的研究。1.精子预处理对牛精子顶体及质膜的影响本研究目标为筛选高效、安全的去除牛精子顶体和质膜方法,初步分析其对精子解聚潜力的影响,并探讨精子获能在其中发挥的作用。首先利用花生凝集素(FITC-PNA)和麦胚凝集素(FITC-WGA)分别标记了牛精子顶体和质膜,定量分析了钙离子载体(Ca A23187)、曲通-100(TX-100)和溶血卵磷脂(LL)三种不同顶体和质膜去除剂以及去除前是否获能对精子顶体和质膜状态的影响。通过细胞死活检测和吖啶橙染色,评定了顶体和质膜处理对精子活力和染色质完整性的影响。最后,在未使用卵母细胞的前提下,利用二硫苏糖醇(DTT)检测了牛精子获能和/或顶体、质膜去除后的解聚潜能。主要研究结果如下：(1)TX-100(61.53±2.06%)和LL(51.87±2.53%)组精子的顶体去除率均显著(P<0.05)高于对照(25.81士2.99%)和Ca A23187(33.10士4.73%)LL组精子质膜去除率(62.89士1.72%)显著(P<0.05)高于对照组(10.38士1.99%)、Ca A23187组(30.13士1.72%)和TX-100组(33.00士1.99%)。与体外获能处理联合,能进一步提高(P<0.05)顶体和质膜的移除效率。(2)去除精子顶体和质膜虽导致精子活力从35.7%(对照组)下降至0-21.5%,但不会影响精子染色质完整性。(3)与对照比,TX-100和LL处理组显著降低了对DTT诱导解聚不敏感的精子所占比例(6.11士1.00%vs.20.30±0.93%,P<0.05；3.51±0.82%vs.20.30±0.93%,P<0.05)。若将精子获能与LL处理相结合可显著增加高度解聚精子所占比例(54.60±1.98%vs.15.62士1.61,P<0.05)。2.精子获能联合顶体和质膜去除对牛孤雄胚胎发育的影响本研究目的是以牛精子克隆孤雄(SpC-AG)胚胎为载体,进一步比较和分析精子获能以及去除顶体和质膜的预处理方法对精子在卵胞质内的解聚能力、解聚同步性、以及孤雄胚胎发育潜能的影响。构建的SpC-AG胚胎根据注射前的精子预处理方法分组,即获能(CM)、TX-10、LL、获能后TX-100处理(CM+TX-100)、获能后LL处理(CM+LL)以及空白对照。首先,利用荧光染色的方法观察了各组胚胎内精子的解聚情况,并比较了各组胚胎的体外发育能力。其次,取各组中已卵裂但不能发育至囊胚的胚胎进行细胞核形态观察,检测胚胎内核质发育的同步性。最后,将实验中得到的桑葚胚和囊胚移植入代孕母牛,以观察其植入后发育能力。主要研究结果如下：(1)LL预处理精子显著提高了构建的SpC-AG胚胎内两个精子同步解聚率(51.1%vs.23.3%,P<0.05)。注射两个CM+LL精子具有最高的精子同步解聚率(72.2%)和原核形成率(46.3%)。这表明精子注射前去除顶体和质膜可增强其在SpC-AG胚胎的解聚能力,而获能可能对精子在卵胞质内的染色质重构有促进作用。(2)首次得到发育至囊胚期的牛精子克隆孤雄胚胎。TX-100或LL去除顶体和质膜能显著(P<0.05)降低注射后胞质碎裂发生频率。LL组SpC-AG胚胎的8-细胞发育率、桑葚胚和囊胚发育率均显著(P<0.05)高于对照组。CM、CM+TX-100和CM+LL处理都能显著(P<0.05)提高SpC-AG囊胚生产效率。(3)LL处理精子显著提高了卵裂的SpC-AG胚胎内核质同步发育能力(64.1%vs.19.7%,P<0.001),同时卵裂球内精子未解聚的情况显著减少(10.9%vs.47.5%,P<0.001)。(4) SpC-AG胚胎移植后没有观察到母牛发生妊娠,但代孕母牛返情期被延长,暗示胚胎可能在妊娠早期丢失。3.母牛热应激对牛单性生殖胚胎发育的影响为检测母牛热应激对牛单性生殖胚胎发育是否有影响,本研究以THI为衡量热应激指示信号,并将卵母细胞供体母牛所受热应激分为无热应激(THI<72)、轻度热应激(72≤THI<80)和中高度热应激(THI≥80)三个程度,分析了母牛热应激对共计2585枚卵母细胞体外成熟率以及2807枚ICSI、孤雌和孤雄生殖胚胎发育能力的影响,并探讨了母牛热应激与卵母细胞成熟率以及三类胚胎发育率的相关性。主要研究结果如下：(1)供体母牛体内卵泡发育时的THI对卵母细胞体外成熟率有影响(P<0.05),且两者呈负相关(r=-0.37)。轻度热应激(72≤THI<80)对卵母细胞体外成熟率没有影响,但中高度热应激组(THI≥80)成熟率显著降低(52.1±2.9%vs63.2±2.3%,P<0.01)。(2)供体母牛体内卵泡发育时的THI对后续生产的ICSI胚胎的卵裂率(P<0.01)、4-8细胞发育率(P<0.001)和≥16细胞发育率(P<0.05)有影响,且与后两者存在负相关(r=-0.52和-0.40)。中高度热应激(THI≥80)组胚胎各阶段发育率均显著降低(P<0.05)(3)未检测到供体母牛体内卵泡发育时的THI对孤雌胚胎卵裂率有影响,但对其4-8细胞发育率(P<0.01)和≥16发育率(P<0.05)有影响,且均存在负相关(r=-0.41和-0.45)。THI≥72时,孤雌胚胎4-8细胞发育率均显著(P<0.05)低于THI<72时的发育情况。THI≥80时,孤雌胚胎4-8细胞发育率和≥16细胞发育率均显著低于THI<72。(4)未检测到供体母牛体内卵泡发育时的THI对孤雄胚胎发育能力的影响。4.甜菜碱的抗热应激生理功能研究本研究旨在以三维立体培养的奶牛乳腺上皮细胞为体外模型,探究甜菜碱是否能帮助哺乳动物细胞抵抗热应激不良影响。利用实时定量PCR、TdT介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)检测和3,3’-[1-(苯氨酰基)-3,4-四氮唑卜二(4-甲氧基-6-硝基)苯磺酸钠(XTT)检测分别调查分析了正常和热应激条件下,甜菜碱对奶牛乳腺上皮细胞热休克蛋白(HSP)表达水平、细胞凋亡和细胞活力的影响,论证了甜菜碱协助哺乳动物细胞抵抗热应激损伤的生理作用,为将其应用于降低母牛热应激的负面影响提供了理论支撑。主要结果如下：(1)热应激条件下,甜菜碱维持了细胞基本形态,显著降低了细胞凋亡率(P<0.0001)并提高了细胞活力(P<0.05)(2)热应激条件下,甜菜碱维持了细胞表达HSP70和HSP27的能力。(3)正常条件下,甜菜碱降低了细胞HSP需要量并加快了细胞增殖率。本文得出的主要结论为：获能与溶血卵磷脂联合处理能高效地去除牛精子顶体和质膜,并增强了精子在卵胞质内的解聚能力、提高了牛孤雄生殖胚胎发育能力；供体母牛卵泡发生时所处环境的THI可作为母牛热应激的指示信号,母牛热应激降低了牛ICSI和孤雌生殖胚胎发育能力;甜菜碱减弱了热应激对奶牛乳腺上皮细胞的细胞凋亡、细胞活力和热休克蛋白表达能力下降等负面影响,具有抗奶牛热应激的应用潜力。

全文目录


摘要  10-14
Abstract  14-19
缩略语表  19-20
第一部分 文献综述  20-34
  1 哺乳动物单性生殖胚胎研究意义  20-24
    1.1 单性生殖胚胎应用于基因组印记研究  20-22
    1.2 单性生殖胚胎干细胞的应用  22-23
    1.3 孤雄生殖胚胎应用于哺乳动物基因修饰  23-24
  2 家畜单性生殖胚胎发育存在的问题  24-31
    2.1 精子注射技术缺陷与预处理的必要性  24-28
      2.1.1 家畜精子注射技术存在的问题  24-26
      2.1.2 精子预处理应当模仿正常受精过程  26-28
    2.2 供体母畜热应激对卵母细胞质量的损害及其衡量方法的缺陷  28-31
      2.2.1 母畜热应激改变了卵母细胞发育环境  29-30
      2.2.2 母畜热应激损害卵母细胞质量  30
      2.2.3 母畜热应激降低卵母细胞发育能力  30
      2.2.4 以季节评价母畜热应激的缺陷  30-31
  3 甜菜碱的潜在抗热应激作用与体外细胞模型优势  31-33
    3.1 目前尚无减弱母牛热应激危害的有效营养管理方案  31-32
    3.2 甜菜碱的生理功能与抗母牛热应激应用潜力  32
    3.3 三维培养的乳腺上皮细胞模型是理想的奶牛热应激研究工具  32-33
  4 本研究目的和意义  33-34
第二部分 实验研究  34-102
  实验研究一：精子预处理对牛精子顶体及质膜的影响  34-51
    1 引言  34-35
    2 材料与方法  35-40
      2.1 实验材料  35-37
        2.1.1 主要仪器和设备  35-36
        2.1.2 主要试剂和药品  36
        2.1.3 溶液与培养液的配方及配制  36-37
      2.2 实验方法  37-39
        2.2.1 精子的准备和处理  37
        2.2.2 精子顶体和质膜状态测定  37-38
        2.2.3 精子活力的评价  38
        2.2.4 精子染色质完整性的评价  38
        2.2.5 精子去凝缩测试  38-39
      2.3 实验设计  39-40
        2.3.1 精子顶体和质膜状态测定  39
        2.3.2 精子活力的评价  39
        2.3.3 精子染色质完整性的评价  39-40
        2.3.4 精子去凝缩测试  40
      2.4 数据统计  40
    3 实验结果  40-47
      3.1 精子获能可提高顶体和质膜的去除效率  40-44
      3.2 去除顶体和质膜对精子活力的影响  44
      3.3 去除顶体和质膜对精子染色质完整性的影响  44-45
      3.4 精子获能和顶体、质膜的去除有利于精子的去凝缩  45-47
    4 讨论  47-50
      4.1 获能对精子膜的稳定性的影响  47
      4.2 顶体和质膜去除方法及其安全性  47-49
      4.3 获能和去除顶体与质膜在精子去凝缩过程中的作用  49-50
    5 小结  50-51
  实验研究二：精子获能联合顶体和质膜去除对牛孤雄胚胎发育的影响  51-70
    1 引言  51-52
    2 材料与方法  52-59
      2.1 实验材料  52-55
        2.1.1 主要仪器和设备  52-53
        2.1.2 主要试剂和药品  53
        2.1.3 培养液的配制  53-54
        2.1.4 捡卵针和显微操作针的制作  54-55
      2.2 实验方法  55-58
        2.2.1 精子的准备  55
        2.2.2 卵母细胞的准备  55-56
        2.2.3 卵母细胞去核  56
        2.2.4 精子注射  56-57
        2.2.5 胚胎的激活和体外培养  57
        2.2.6 细胞学检测  57
        2.2.7 胚胎移植  57-58
      2.3 实验设计  58
        2.3.1 精子处理和胚胎分组  58
        2.3.2 精子获能和预处理对精子卵胞质内解聚的影响  58
        2.3.3 精子获能和预处理对孤雄胚胎发育的影响  58
      2.4 数据统计  58-59
    3 结果  59-65
      3.1 精子预处理对孤雄生殖胚胎内两个精子同步解聚和原核形成的影响  59-64
      3.2 精子预处理对精子克隆孤雄胚发育潜能的影响  64-65
    4 讨论  65-69
      4.1 精子获能对精子能育力的影响  66-67
      4.2 顶体和质膜的去除有利于注射后精子的染色质重构  67-68
      4.3 精子克隆孤雄胚胎发育受限因素  68-69
    5 小结  69-70
  实验研究三：母牛热应激对牛单性生殖胎发育的影响  70-85
    1 引言  70-71
    2 材料与方法  71-76
      2.1 实验材料  71-73
        2.1.1 主要仪器与设备  71
        2.1.2 主要试剂和药品  71
        2.1.3 培养液的配制  71-72
        2.1.4 捡卵针和显微操作针的制作  72
        2.1.5 气象数据  72-73
      2.2 实验方法  73-74
        2.2.1 卵母细胞和精子的准备  73
        2.2.2 卵母细胞成熟的观察  73
        2.2.3 ICSI胚胎的生产  73
        2.2.4 孤雌生殖胚胎生产  73
        2.2.5 孤雄生殖胚胎的生产  73
        2.2.6 胚胎体外培养与观察记录  73-74
      2.3 实验设计  74-75
        2.3.1 武汉地区气象数据的统计  74
        2.3.2 热应激对卵母细胞成熟率和体外胚胎发育的影响  74-75
        2.3.3 THI与卵母细胞体外成熟率和胚胎发育率的相关性分析  75
      2.4 统计分析  75-76
    3 结果  76-81
      3.1 湖北武汉地区热应激天气概况  76-77
      3.2 母牛热应激对卵母细胞成熟率的影响  77
      3.3 母牛热应激对ICSI胚胎发育的影响  77-78
      3.4 母牛热应激对孤雌生殖胚胎发育的影响  78-79
      3.5 母牛热应激对孤雄生殖胚胎发育的影响  79-80
      3.6 采卵前THI与卵母细胞体外成熟率和单性生殖胚胎发育率的相关性分析  80-81
    4 讨论  81-84
      4.1 THI是热应激效应的重要指示标志  82-83
      4.2 母畜热应激对卵母细胞质量和发育潜力的影响  83-84
    5 小结  84-85
  实验研究四：甜菜碱的抗热应激生理功能研究  85-102
    1 引言  85-86
    2 材料方法  86-94
      2.1 实验材料  86-88
        2.1.1 主要仪器与设备  86-87
        2.1.2 主要试剂与药品来源  87
        2.1.3 培养液与溶液的配制  87-88
      2.2 实验方法  88-92
        2.2.1 奶牛乳腺上皮细胞的分离  88
        2.2.2 奶牛乳腺上皮细胞的三维培养  88-89
        2.2.3 提取RNA  89
        2.2.4 基因组DNA的去除和cDNA合成  89-90
        2.2.5 实时定量PCR  90
        2.2.6 TUNEL法细胞凋亡检测  90-91
        2.2.7 细胞活力和增殖检测  91-92
      2.3 实验设计  92-93
        2.3.1 甜菜碱处理对奶牛乳腺上皮细胞中高温诱导的热应激反应的影响  92
        2.3.2 甜菜碱对热应激诱导的乳腺上皮细胞凋亡的影响  92
        2.3.3 甜菜碱对乳腺上皮细胞活力和增殖的影响  92-93
      2.4 数据统计  93-94
    3 结果  94-98
      3.1 甜菜碱对乳腺上皮细胞活力和增殖的影响  94
      3.2 甜菜碱能减弱热应激诱导的细胞凋亡  94-95
      3.3 甜菜碱对牛乳腺上皮细胞中热休克蛋白表达的双重作用  95-98
    4 讨论  98-101
      4.1 甜菜碱对热休克的细胞中热应激反应的影响  98-99
      4.2 甜菜碱对热休克的细胞活力和凋亡的影响  99-100
      4.3 甜菜碱对细胞生长的影响  100-101
    5 小结  101-102
第三部分 全文结论  102-104
参考文献  104-133
致谢  133-135
附录  135-136

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 家畜 > 牛
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