学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

刺槐内共生细菌的重金属抗性机制及其与植物的联合修复作用

作　者: 郝秀丽
导　师: 韦革宏
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 微生物学
关键词: 土壤杆菌中慢生根瘤菌生物吸附重金属抗性植物修复
分类号: S792.27
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
下　载: 51次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

根瘤菌-豆科植物共生体系在重金属污染土壤的生物修复中具有很大的应用前景，而揭示根瘤菌的重金属抗性机制及其在金属胁迫下和植物的共生关系是运用根瘤菌-豆科植物联合修复系统的基础和前提。本文通过全基因组测序分析、转座子突变等技术，对分离自甘肃铅锌矿区刺槐（Robinia pseudoacacia）根瘤中的两株重金属抗性细菌Agrobacterium tumefaciens CCNWGS0286及Mesorhizobium amorphae CCNWGS0123的Cu/Zn抗性机制、以及对Cu/Zn污染土壤的联合修复作用进行了研究。经测定，Cu²⁺对菌株CCNWGS0286和CCNWGS0123的最小抑制浓度（MIC）分别为2.8mM、2.5mM，而Zn²⁺对菌株的MIC分别为3.0mM、2.0mM。菌体对Zn²⁺的最适吸附条件及生物吸附特征的研究表明，在应用菌株CCNWGS0286和CCNWGS0123的活体细胞作为生物吸附剂时，对Zn²⁺生物吸附的最适条件为pH：5.0，生物吸附剂剂量：1.0g/L，初始金属浓度：100mg/L。多种动力学模型拟合结果表明，二级动力学模型能更加准确的描述菌株对Zn²⁺的吸附过程。Langmuir和Freundlich模型对菌体CCNWGS0286和CCNWGS0123吸附拟合效果不尽相同，但两菌株作为生物吸附剂对Zn²⁺的吸附均属于化学吸附。此外，两株菌体吸附剂均在pH为1.0时解析效率最高，达70%以上。结合傅里叶红外光谱、扫描电镜及能谱分析等方法，最终确定了-COOH、C=O、-NH和-C6H5等官能团主要参与了菌体吸附剂对Zn²⁺的吸附过程，而菌体可通过细胞形态变化和胞外分泌物的产生等途径增强菌体对Zn²⁺的抗性。A. tumefaciens CCNWGS0286（176）具有良好的重金属抗性及促植物生长能力。基于全基因组序列分析，发现并预测了A. tumefaciens176基因组中与锌抗性相关的基因及操纵子。通过转座子突变技术，建立了库容为7600的突变体文库，并从中筛选出9个锌敏感突变体。敏感性实验证明，多数突变体对Zn²⁺和Cd²⁺专一敏感、且敏感程度较高，此外，其中一株锌敏感突变体15-6IAA分泌能力显著下降。结合全基因组序列分析、转座子突变获得的插入基因以及锌抗性相关基因RT-PCR结果，最终确定在A.tumefaciens176中，P1b-type APTase ZntA-4200及MerR family转录调节因子ZntR1在维持细菌Zn和Cd抗性/稳态中起主要作用。此外，脂转运蛋白基因的缺失对菌体Zn²⁺、Cd²⁺抗性及IAA合成均有不同程度的影响，但其作用机制还不明确，可能与细菌的某些代谢活动相关。植物实验表明，A. tumefaciens176在Zn²⁺胁迫条件下仍能促进刺槐生长。通过菌株促植物生长因子测定及KEGG代谢途径分析，证明菌株能过量分泌吲哚乙酸（IAA），且IAA分泌量受Zn²⁺影响较小，因此推断能过量分泌IAA是A. tumefaciens176在Zn²⁺胁迫下促进植物生长最主要的原因。通过比较Zn²⁺胁迫条件下，野生菌176（ZnR，IAA+）、突变体12-2（ZnS，IAA+）、突变体15-6（ZnS， IAA-）以及参比菌株C58（ZnR，IAA-）对刺槐生长的促进作用，最终证明细菌金属抗性基因不能对抗或缓解金属对植物的毒害，植物生长激素才是污染条件下辅助植物存活、生长的主要因素。本研究全面分析了M. amorphae CCNWGS0123（186）全基因组序列特征，以及潜在的铜抗性相关基因及操纵子。同时结合转座子突变技术，构建了库容为10,000余株的突变体库，并筛选获得8个铜敏感性突变株。所有突变体Tn5插入基因主要分为三种类型：P-type ATPase、未知功能蛋白、及其他（GTP结合蛋白、核蛋白）。转座子突变基因及RT-PCR结果表明，CopA-6910和CusB共同决定M. amorphae186对铜的抗性。其中，CopA-6910主要负责将细胞质中的一价Cu排出到周质空间，而CusAB主要负责将周质空间内的一价Cu排出到细胞外，从而降低周质空间一价Cu的毒害。促植物生长因素测定结果表明，共生固氮能力是M. amorphae186在铜胁迫环境下辅助刺槐生长的主要因素。野生型菌株186及其铜敏感突变体3-42（copA::Tn5）和34-28（ccmX::Tn5）均可与宿主植物共生结瘤，但突变体34-28由于CcmX的缺失，其有效根瘤数量、固氮能力、促植物生长能力、及接种植物中Cu富集量均受到不同程度的影响。这说明CcmX的缺失，不仅影响菌株的铜抗性水平，同时还影响了菌株与宿主刺槐的共生结瘤过程，推测该基因可能与铜离子参与cbb3细胞色素c氧化酶系统中的催化过程有关。铜胁迫条件下植物实验表明，接种有186的刺槐，其全N含量、生物量以及Cu富集量比未接种的植物均有显著增加，且刺槐根中富集的Cu远远高于茎叶Cu富集量，进一步说明了将根瘤菌-刺槐共生体系用于修复矿区重金属污染环境的潜能。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-13
第一章文献综述  13-37
  1.1 引言  13-14
  1.2 微生物的铜、锌抗性机制  14-20
    1.2.1 微生物对铜的抗性机制  14-17
    1.2.2 微生物对锌的抗性机制  17-19
    1.2.3 具有重金属抗性的根瘤菌  19-20
  1.3 豆科植物-根瘤菌共生系统辅助下的植物修复作用  20-35
    1.3.1 豆科植物可作为先锋植物用于土壤重金属污染修复  21-23
    1.3.2 重金属污染条件下具有重金属抗性的根瘤菌对豆科植物的辅助作用  23-34
    1.3.3 重金属对共生体系的毒害  34-35
  1.4 研究内容及技术路线  35-37
    1.4.1 研究内容  35
    1.4.2 研究技术路线  35-37
第二章 A. tumefaciens CCNWGS0286 和 M. amorphae CCNWGS0123 重金属抗性特征及吸附特性研究  37-60
  2.1 引言  37
  2.2 实验材料及设备  37
    2.2.1 细菌及培养基  37
    2.2.2 实验试剂  37
    2.2.3 仪器设备  37
  2.3 实验方法  37-45
    2.3.1 供试菌株的分离、筛选及鉴定  37-42
    2.3.2 供试菌株的吸附条件优化  42
    2.3.3 供试菌株的吸附特性研究  42-44
    2.3.4 供试菌株的吸附机制研究  44-45
  2.4 结果与分析  45-58
    2.4.1 16S rDNA 系统发育分析  45-46
    2.4.2 供试菌株的抗性特征及生理生化特性  46-49
    2.4.3 pH、吸附剂剂量、起始金属浓度以及吸附时间对供试菌株吸附能力的影响  49-51
    2.4.4 供试菌株的吸附动力学研究  51-53
    2.4.5 吸附等温方程  53-54
    2.4.6 解析作用  54-55
    2.4.7 金属胁迫下供试菌株的红外光谱分析（FT-IR）  55-56
    2.4.8 金属胁迫下供试菌株的扫描电镜（SEM）及能谱分析（EDX）  56-58
  2.5 讨论  58-60
第三章 A. tumefaciens CCNWGS0286 锌抗性机制及促植物生长特性研究  60-96
  3.1 引言  60
  3.2 实验材料及设备  60-62
    3.2.1 细菌及培养基  60-61
    3.2.2 实验试剂  61-62
    3.2.3 仪器设备  62
  3.3 实验方法  62-68
    3.3.1 全基因组测序及序列注册  62
    3.3.2 Tn5 转座子突变条件筛选  62-63
    3.3.3 Tn5 转座子突变体库的建立、锌敏感突变体的筛选及 Tn5 插入位点的确定  63-64
    3.3.4 重金属对锌敏感突变体生长的影响  64-65
    3.3.5 锌抗性相关基因的表达及共转录分析  65-66
    3.3.6 A. tumefaciens CCNWGS0286 及锌敏感突变体促植物生长因子的测定  66-67
    3.3.7 A. tumefaciens CCNWGS0286 及锌敏感突变体对植物生长的影响  67-68
  3.4 结果与分析  68-94
    3.4.1 A. tumefaciens CCNWGS0286 全基因组及锌抗性相关基因预测  68-73
    3.4.2 转座子突变条件  73-75
    3.4.3 突变体库的建立及锌敏感突变体的筛选  75-77
    3.4.4 转座子突变确定 A. tumefaciens CCNWGS0286 的锌抗性基因  77-80
    3.4.5 ZntR1 和 ZntA-4200 在 Zn 和 Cd 抗性系统中起主要作用  80-82
    3.4.6 A. tumefaciens CCNWGS0286 促植物生长因子及代谢途径分析  82-92
    3.4.7 锌胁迫条件下菌株的抗性水平及产植物激素（IAA）的能力对植物生长的影响  92-94
  3.5 讨论  94-96
第四章 M. amorphae CCNWGS0123 铜抗性机制及与刺槐共生体系在铜污染修复中的作用  96-129
  4.1 引言  96
  4.2 实验材料及设备  96-97
    4.2.1 细菌及培养基  96-97
    4.2.2 实验试剂  97
    4.2.3 仪器设备  97
  4.3 实验方法  97-105
    4.3.1 全基因组测序及序列注册  97
    4.3.2 转座子突变及铜敏感突变体的筛选  97-98
    4.3.3 Tn5 插入位点的确定  98-100
    4.3.4 重金属对铜敏感突变体生长的影响  100
    4.3.5 铜抗性相关基因的表达分析  100
    4.3.6 M. amorphae CCNWGS0123 及其铜敏感突变体促植物生长因子测定  100-101
    4.3.7 盆栽实验  101-102
    4.3.8 刺槐根、茎叶中 N、P、K 及 Cu 含量的测定  102-103
    4.3.9 荧光定量 PCR 测定根瘤中豆血红蛋白的表达  103-104
    4.3.10 石蜡切片观察根瘤形态结构  104-105
  4.4 结果与分析  105-127
    4.4.1 M. amorphae CCNWGS0123 全基因组及重金属抗性相关基因预测  105-110
    4.4.2 转座子突变条件  110-112
    4.4.3 突变体库的建立及铜敏感突变体的筛选  112-113
    4.4.4 M. amorphae CCNWGS0123 铜抗性相关基因功能确定  113-118
    4.4.5 M. amorphae CCNWGS0123 基因组中其他铜抗性相关基因的表达  118-119
    4.4.6 铜敏感突变体的固氮、结瘤能力  119-122
    4.4.7 铜胁迫条件下铜敏感突变体对宿主植物生长的影响  122-126
    4.4.8 铜敏感突变体对宿主植物根和茎叶铜含量的影响  126-127
  4.5 讨论  127-129
第五章总结  129-132
  5.1 结论  129-131
    5.1.1 A. tumefaciens 176 及 M. amorphae 186 重金属抗性特征及吸附特性  129
    5.1.2 A. tumefaciens 176 的锌抗性机制及促植物生长特性  129-130
    5.1.3 M. amorphae 186 的铜抗性机制及与刺槐共生体系在铜污染修复中的作用  130-131
  5.2 创新点  131-132
参考文献  132-147
附录  147-159
缩略词 (Abbreviations）  159-160
致谢  160-162
作者简介  162-163
发表及待发表的相关学术论文  163

刺槐内共生细菌的重金属抗性机制及其与植物的联合修复作用

内容摘要

全文目录

相似论文