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根癌农杆菌介导的抗寒基因转化突尼斯软籽石榴研究

作　者: 郭晓丽
导　师: 陈延惠
学　校: 河南农业大学
专　业: 果树学
关键词: 突尼斯软籽石榴遗传转化农杆菌抗寒基因激素愈伤组织
分类号: S665.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

突尼斯软籽石榴因其早果丰产、果形美观、裂果轻、皮薄、味甜多汁，尤其是核仁极软、成熟期恰逢仲秋，成为目前黄河以南石榴栽培中的优良品种，但因其抗寒能力较差，在低温年份时，生产栽培中的易出现冻害现象，这已经成为不容忽视的问题。运用传统的育种手段进行品种的改良，由于受到周期长、自交不亲和及基因间的紧密连锁等因素的影响而导致育种进程缓慢。基因工程的出现，成为实现目标性状改良的一种快速的有效途径。本试验利用农杆菌介导的遗传转化体系，将抗寒基因转入到突尼斯软籽石榴中，以期获得抗寒的新种质。主要的研究结果如下：1.对LBA4404和EHA105两种农杆菌菌株遗传转化力的研究，结果表明LBA4404侵染能力较强，得到的转化苗数多于EHA105菌株，但就污染率和褐化率来说，EHA105菌株的污染率和褐化率则低于LBA4404菌株。但对于最佳的农杆菌菌株的优化还需要进一步实验研究。2.通过对遗传转化过程中共培养温度的研究，结果表明在19°C的共培养条件下，叶片和愈伤组织的污染率和褐化率得到明显改善，其中愈伤组织经过共培养培养和筛选培养之后，得到抗性愈伤组织和抗性芽，因此，适宜突尼斯软籽石榴遗传转化的共培养温度为19°C3.分别以突尼斯软籽石榴的叶片、愈伤组织作为外植体进行抗寒基因的遗传转化，研究结果表明，突尼斯软籽石榴的愈伤组织作为外植体，进行农杆菌的侵染，得到了抗性愈伤组织，并有转化苗的分化。因此，愈伤组织为良好的外植体侵染材料。4.优化选择转化苗再生体系，结果表明侵染过的愈伤组织第一次继代的最佳培养基为：MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L+GA0.3mg/L+KT1.0mg/L+PVP1.0g/L+Kan50mg/L+Cef500mg/L，抗性芽伸长生长的最佳培养基为：MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L+GA0.3mg/L+KT1.0mg/L+PVP1.0g/L+Cef500mg/L+Kan50mg/L。5.提取LBA4404农杆菌菌株的质粒DNA，经过1%琼脂糖凝胶电泳扩增出条带，得到的质粒DNA可以用于抗性愈伤组织和抗性芽的检测。

全文目录

致谢  4-8
摘要  8-9
缩略词  9-10
1.文献综述  10-22
  1.1 研究背景  10-11
  1.2 果树抗寒育种研究进展  11-12
    1.2.1 果树抗寒种质资源方面的研究  11
    1.2.2 果树抗寒性遗传及育种研究  11-12
      1.2.2.1 果树抗寒性遗传  11
      1.2.2.2 果树抗寒性育种  11-12
  1.3. 果树遗传转化的研究进展  12-22
    1.3.1 遗传转化的植物种类  12
    1.3.2 遗传转化方法的研究  12-14
      1.3.2.1 直接基因转移方法  12-13
      1.3.2.2 根癌农杆菌介导的遗传转化  13-14
    1.3.3 受体材料  14-16
      1.3.3.1 外植体的类型和生理状态  14-15
      1.3.3.2 受体材料再生体系的建立与遗传转化  15-16
    1.3.4 影响根癌农杆菌介导的遗传转化效率的因素  16-18
      1.3.4.1 农杆菌的菌株类型  16-17
      1.3.4.2 农杆菌菌液的浓度  17
      1.3.4.3 共培养的时间  17
      1.3.4.4 共培养的温度  17
      1.3.4.5 基因活化的诱导物  17-18
      1.3.4.6 外植体的细胞状态对转化的影响  18
    1.3.5 转入基因的类型  18-20
      1.3.5.1 选择标记基因和报告基因  19
      1.3.5.2 抗性基因  19-20
      1.3.5.3 品质相关基因  20
    1.3.6 转基因的检测与鉴定方法  20-22
      1.3.6.1 标记基因的筛选及鉴定  20-21
      1.3.6.2 分子鉴定  21-22
2.引言  22-23
3.材料和方法  23-27
  3.1 试验材料  23-24
    3.1.1 供试植株  23
    3.1.2 供试农杆菌菌株和质粒  23
    3.1.3 石榴叶片组织培养的主要培养基  23-24
    3.1.4 主要的生化试剂  24
    3.1.5 主要仪器  24
  3.2 外植体材料的准备  24
  3.3 农杆菌遗传转化  24-26
    3.3.1 农杆菌菌液的制备  24-25
      3.3.1.1 农杆菌菌株的活化  24
      3.3.1.2 单菌落的繁殖  24-25
    3.3.2 预培养  25
    3.3.3 侵染与共培养  25
    3.3.4 共培养温度  25
    3.3.5 筛选培养  25-26
  3.4 质粒 DNA 的提取  26-27
4.结果分析  27-32
  4.1 不同菌株类型对侵染力的影响  27
  4.2 不同共培养温度对遗传转化污染率和褐化率的影响  27-28
    4.2.1 不同共培养温度对叶片遗传转化污染率和褐化率的影响  27
    4.2.2 不同共培养温度对愈伤组织遗传转化污染率和褐化率的影响  27-28
  4.3 不同类型外植体的遗传转化结果分析  28-29
  4.4 不同筛选培养基配方对抗性芽再生的影响  29
  4.5 石榴愈伤组织的转化再生  29-30
  4.6 石榴叶片的转化再生  30-31
  4.7 质粒 DNA 提取  31-32
5.结论与讨论  32-35
  5.1 结论  32
  5.2 讨论  32-35
    5.2.1 不同类型外植体的遗传转化  32-33
    5.2.2 不同芽再生培养基激素浓度对转化苗再生的影响  33
    5.2.3 提高农杆菌转化效率的方法  33-35
参考文献  35-42
ABSTRACT  42-44
图版说明  44-47

根癌农杆菌介导的抗寒基因转化突尼斯软籽石榴研究

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