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MdMYB10位点影响苹果果实品质的研究

作　者: 李燊
导　师: 郝玉金
学　校: 山东农业大学
专　业: 果树学
关键词: 红肉苹果 MdMYB10 果实品质苹果酸可溶性糖
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

苹果是中国乃至世界最重要的鲜食和加工果品之一。苹果果实的品质性状有很多，如果实颜色、香气、硬度、脆度、口感等。其中果实色泽是重要的外观品质，是广大消费者最为看重的品质之一，因此也受到很多育种专家的关注。但是果实的着色对果实其它品质是否会造成影响，目前研究不多。探索果实色泽与其它品质性状之间的关系，能为培育色泽优、口感好、营养价值高的红肉苹果新品种提供参考。果实的颜色主要是由花青苷的积累造成的，花青苷的积累受众多保守性很强的转录因子调控。在苹果中，MdMYB10基因调控果肉和叶片的颜色，MdMYB1基因调控果皮的颜色。本研究使用‘红肉’苹果与‘富士’苹果的杂交群体，选择红肉与白肉苹果，研究引起其果肉颜色差异的原因，测定其果实品质，探索果肉色泽与果实品质的关系。主要研究工作与结果如下：1.半定量RT-PCR结果显示，在苹果发育过程中，红肉苹果果实中MdMYB10基因表达量比白肉苹果要高。同时Western blot结果也证明了红肉苹果果实中的MdMYB10蛋白的含量也高于白肉苹果。2.通过测量果实的生理指标发现，与白肉苹果相比，从果实的发育到成熟，红肉苹果果个稍小，但是硬度、脆度影响不大；利用气相色谱法测定乙烯释放速率，发现乙烯释放趋势大致相同，但是在成熟期红肉苹果乙烯释放开始增高的稍晚，释放量要低一些。3.利用液相色谱的方法，测定果实中糖酸含量，结果发现，红肉苹果苹果酸含量高于白肉苹果，并且红肉苹果果糖含量高，葡萄糖和蔗糖含量低，甜度高。4.检测MdMYB10的转基因‘王林’愈伤和野生型‘王林’愈伤中苹果酸的含量，和苹果酸相关基因的表达量，发现在转基因愈伤中苹果酸含量高，并且苹果酸相关基因大部分都上调。5.利用RNA-seq的方法，对比野生型‘王林’愈伤和MdMYB10的转基因‘王林’愈伤的基因表达差异，鉴定MdMYB10影响果实品质的分子机理，发现：MdMYB10、光合作用、果实品质三者之间可能存在相关关系。另外MdMYB10可能通过调控下游其他基因包括激酶基因、水解酶基因等调控糖代谢进而影响果实的品质。

全文目录

中文摘要  10-11
Abstract  11-13
1 引言  13-24
  1.1 苹果的基本概况  13-15
    1.1.1 苹果的种类与分布  13-14
    1.1.2 苹果的品质  14
    1.1.3 红肉苹果研究进展  14-15
  1.2 花青素及其衍生物  15-16
  1.3 MYB 家族转录因子  16-19
    1.3.1 转录因子的基本概念  16-17
    1.3.2 MYB 家族转录因子  17-19
  1.4 MdMYB10 的功能研究  19-20
    1.4.1 MdMYB10 调控苹果果实颜色  19
    1.4.2 MdMYB10 影响苹果果实的其他品质  19-20
  1.5 RNA-seq  20-23
    1.5.1 RNA-seq 原理  20
    1.5.2 RNA-seq 流程  20-21
    1.5.3 RNA-seq 测序文库制备  21-22
    1.5.4 RNA-seq 信息分析流程  22-23
  1.6 本研究的目的和意义  23-24
2 材料与方法  24-38
  2.1 试验材料  24-25
    2.1.1 植物材料  24
    2.1.2 植物材料培养与处理  24
    2.1.3 菌株及载体  24
    2.1.4 酶、试剂盒、生化试剂、培养基等  24
    2.1.5 仪器与设备  24-25
    2.1.6 PCR 引物  25
  2.2 试验方法  25-38
    2.2.1 植物总 RNA 的提取  25-27
      2.2.1.1 CTAB 法提取 RNA  25-26
      2.2.1.2 RNA-seq 总 RNA 提取  26
      2.2.1.3 总 RNA 提取  26-27
      2.2.1.4 Trizol 试剂盒法提取 RNA  27
    2.2.2 总 RNA 含量与纯度检测  27
    2.2.3 植物 RNA 的纯化（除 DNA）方法  27-28
    2.2.4 反转录  28
    2.2.5 RT-PCR 实验体系  28-29
    2.2.6 植物基因组 DNA 的提取及纯化  29-30
      2.2.6.1 天根植物基因组 DNA 提取试剂盒提取愈伤组织总 DNA  29
      2.2.6.2 植物基因组 DNA 的纯化  29-30
      2.2.6.3 基因组 DNA 含量与纯度检测  30
    2.2.7 MdMYB10 基因的克隆  30
      2.2.7.1 PCR 扩增体系  30
    2.2.8 目的片段的回收  30
    2.2.9 连接反应  30-31
    2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化  31-32
      2.2.10.1 大肠杆菌感受态细胞的制备  31-32
      2.2.10.2 大肠杆菌感受态细胞的转化  32
    2.2.11 根癌农杆菌 LBA4404 和 GV3101 感受态细胞的制备与转化  32-33
      2.2.11.1 农杆菌感受态细胞的制备  32
      2.2.11.2 电击法转化农杆菌  32-33
    2.2.12 转基因植物材料的获得  33-34
      2.2.12.1 农杆菌介导的苹果转化  33
      2.2.12.2 农杆菌介导的烟草转化  33-34
      2.2.12.3 农杆菌介导的番茄转化  34
    2.2.13 转基因植株的生物学鉴定分析  34
      2.2.13.1 转基因植株的基因组 DNA 鉴定  34
      2.2.13.2 转基因植株的 RT-PCR  34
    2.2.14 相关生理指标测定  34-35
      2.2.14.1 气相色谱发乙烯释放速率的测定  34-35
      2.2.14.2 苹果糖酸含量提取液  35
      2.2.14.3 苹果果实硬度脆度的测定  35
      2.2.14.4 苹果果实甜度的计算  35
    2.2.15 蛋白技术  35-38
      2.2.15.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）  35-36
      2.2.15.2 转膜  36-37
      2.2.15.3 Western Blot 技术  37
      2.2.15.4 植物总蛋白的提取  37-38
3 结果与分析  38-58
  3.1 红肉苹果与白肉苹果中 MdMYB10 基因的表达差异  38-40
    3.1.1 果实不同发育时期，MdMYB10 基因的表达情况  38-39
    3.1.2 果实不同发育时期，MdMYB10 蛋白的表达情况  39-40
  3.2 红肉苹果与白肉苹果果实生理指标的测定  40-43
    3.2.1 红肉苹果与白肉苹果果实的单果重、硬度、脆度  40
    3.2.2 果实发育过程中红肉苹果与白肉苹果果实乙烯释放速率变化  40-41
    3.2.3 红肉苹果与白肉苹果果实乙烯相关基因的表达情况  41-42
    3.2.4 红星苹果着色后对红星苹果果实硬度、脆度、乙烯释放速率的影响  42-43
  3.3 红肉苹果和白肉苹果果实中糖酸含量  43-46
    3.3.1 红肉苹果和白肉苹果果实中糖含量  43-44
    3.3.2 红肉苹果和白肉苹果果实中酸含量  44-45
    3.3.3 红肉苹果和白肉苹果叶片中酸含量差异  45-46
  3.4 MdMYB10 基因影响果实品质的分子机理  46-58
    3.4.1 MdMYB10 转基因王林愈伤的获取  46
    3.4.2 野生型王林愈伤与 MdMYB10 转基因愈伤中苹果酸的含量  46
    3.4.3 野生型王林愈伤与 MdMYB10 转基因愈伤中酸相关基因的表达  46-48
    3.4.4 野生型王林愈伤与 MdMYB10 转基因愈伤 RNA 的提取  48
    3.4.5 野生型王林愈伤与 MdMYB10 转基因愈伤 RNA-seq 结果分析  48-58
      3.4.5.1 RNA-seq 测序数据质量评估  49-50
      3.4.5.2 RNA-seq 数据分析  50-56
        3.4.5.2.1 参考基因组选择  50-51
        3.4.5.2.2 读长比对  51
        3.4.5.2.3 表达差异基因分析  51-53
        3.4.5.2.4 表达差异基因的生物学功能分析  53-56
        3.4.5.2.5 表达差异显著基因功能注释  56
      3.4.5.3 表达差异显著基因定量 PCR 验证  56-58
4 讨论  58-61
5 结论  61-62
参考文献  62-67
附录  67-83
致谢  83-84
攻读学位期间发表和形成的学术论文  84

MdMYB10位点影响苹果果实品质的研究

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