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苹果实生树不同个体发育阶段蛋白质磷酸化差异修饰的研究

作　者: 王艳
导　师: 张新忠；韩振海；王忆
学　校: 中国农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果阶段转变成花转变磷酸化蛋白质组学
分类号: S661.1
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

由于童期较长,导致了苹果的育种周期长。高等植物在个体发育的过程中往往伴随着一系列基因的差异表达以及蛋白质的定性或是定量的变化,但是,多年生木本被子植物的个体发育过程中的生理和分子机制仍不清楚。在之前的研究中发现,一些蛋白酶在苹果实生树的个体发育过程中会发生翻译后修饰的现象,磷酸化修饰作为一个重要的翻译后修饰影响着蛋白的功能及代谢,但它在多年生木本被子植物不同发育阶段所发生的动态变化仍不十分清楚,所以研究磷酸化修饰在苹果实生树不同发育阶段的差异将有可能从蛋白质翻译后水平揭示阶段转变的分子机制,对进一步了解多年生木本被子植物的个体发育具有重要的理论意义。在本研究中,为了确认蛋白质磷酸化修饰在苹果实生树个体发育过程中存在差异以及在不同杂交组合的不同实生树中的一致性,以‘红玉’x‘金冠’和‘紫塞明珠’×‘富士’两个杂交组合,分别为11年生和6年生的苹果实生树为试验材料,提取童期(J),成年营养生长期(V),成年生殖生长期(R)三个不同发育阶段的叶片蛋白,通过对Pro-Q Diamond染色效果进行对比以及蛋白去磷酸化方法进行优化,采用双向电泳与western blotting免疫印迹法结合对S6PDH的磷酸化修饰进行初步验证,确定试验体系。对蛋白进行去磷酸化处理并通过双向电泳对蛋白进行分离,同时将未进行去磷酸化处理的蛋白双向电泳分离之后采用Pro-Q Diamond进行染色,找出在在不同发育阶段差异表达的磷酸化蛋白点,并采用MALDI-TOF-TOF对其进行质谱鉴定。研究结果如下：1、通过与TCA/丙酮提蛋白法相结合优化了苹果叶片蛋白质CIP去磷酸化法,使用此方法可获得背景清晰、分辨率高的双向电泳图谱。利用蛋白质双向电泳和蛋白免疫印迹法Western blotting)对S6PDH在苹果实生树个体发育过程中发生的磷酸化修饰进行鉴定,证明采用CIP对蛋白进行去磷酸化的方法是可行的。2、在三株苹果杂种实生树中共检测出7组差异磷酸化蛋白质,经过MALDI-TOF-TOF质谱鉴定,5组共计107个蛋白质点获得鉴定结果：A6,A33,A48包括55个蛋白点,被鉴定为Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase (Rubisco) large-chain fragments,其蛋白表达量以及磷酸化程度在不同的发育阶段存在差异：A6组蛋白在三株实生树中均表现为生殖生长期蛋白表达量低于童期和成年营养生长期；A33组蛋白中A33-1在3棵实生树中均在童期表达较弱,A33-2在成年营养生长期的蛋白表达量高于童期和成年生殖生长期,A33-3在成年营养生长期的蛋白表达量高于童期和成年生殖生长期,且A33-3的蛋白表达量高于A33-1和A33-2；A48组蛋白中A48-1在3棵实生树中均在成年生殖期蛋白表达量弱,A48-2在成年营养生长期表达高于童期和成年生殖生长期,A48-3在成年营养生长期的表达量低于童期和成年生殖生长期。B38组27个蛋白点被鉴定为Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase activase,这组蛋白点的表达量从童期到成年生殖生长期呈现下降的趋势。B38-2的蛋白表达量在不同实生树的不同发育阶段均高于B38-1和B38-3。C24组的25个蛋白点被鉴定为Tubulin beta chain,低等电点的磷酸化β-tubulin在童期和成年营养生长期的表达量较高,在三棵实生树的不同发育阶段等电点较高的蛋白点C24-3的蛋白表达量高于等电点较低的蛋白点。从这些结果中可以看出蛋白质磷酸化修饰在苹果实生树的个体发育过程中存在差异,且这些差异在不同杂交组合的不同实生树中是一致的。3、在三棵实生树中,叶片净光合速率分别在40节、80节、140节(07-07-115),30节、90节、120节(07-07-133)和30节、90节、140节(07-09-141)出现峰值。随着树体节位的升高,叶片狰光合速率发生变化,但这种变化没有随着节位升高而发生梯度的增加,所以在本试验中被大量鉴定出来与光合作用相关的Rubisco large subunit和Rubisco activase,它们的磷酸化作用与树体节位无关,而是与树体的个体发育相关。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
縮略词  8-9
目录  9-11
第一章文献综述  11-18
  1.1 研究背景  11
  1.2 植物阶段转变的研究进展  11-14
    1.2.1 植物阶段转变过程中植株形态学的变化  11-12
    1.2.2 植物阶段转变过程中生理指标的变化  12-13
    1.2.3 植物阶段转变中核酸的变化  13-14
    1.2.4 植物阶段转变中蛋白质的变化  14
  1.3 蛋白质磷酸化修饰在木本植物上的研究概况  14-17
    1.3.1 蛋白质磷酸化修饰在植物中的研究进展  15-17
    1.3.2 蛋白质磷酸化修饰在植物中的主要研究方法  17
  1.4 本研究的目的及意义  17-18
第二章材料和方法  18-25
  2.1 植物材料  18
  2.2 蛋白质提取  18
  2.3 试验方法的优化  18-20
    2.3.1 Pro-Q diamond稀释液染色效果比较  18-19
    2.3.2 蛋白去磷酸化方法优化  19-20
  2.4 多克隆抗体制备及特异性比较  20
    2.4.1 抗体制备  20
    2.4.2 多克隆抗体特异性比较  20
  2.5 采用S6PDH多克隆抗体对磷酸化修饰进行初步鉴定  20-21
    2.5.1 蛋白质提取  20-21
    2.5.2 2-DE和western blotting对S6PDH的磷酸化修饰进行鉴定  21
  2.6 磷酸化蛋白的分析鉴定  21-23
    2.6.1 蛋白质提取  21
    2.6.2 蛋白质的双向电泳  21-22
    2.6.3 染色及图像分析  22
    2.6.4 蛋白质的鉴定  22-23
  2.7 苹果实生树净光合速率的测定  23-25
第三章结果与分析  25-48
  3.1 试验方法的优化  25-26
    3.1.1 Pro-Q diamond稀释液染色效果比较  25
    3.1.2 蛋白去磷酸化方法优化  25-26
  3.2 多克隆抗体特异性比较  26-27
  3.3 采用S6PDH多克隆抗体对磷酸化修饰的初步鉴定  27-30
  3.4 苹果实生树不同发育阶段差异磷酸化蛋白的分离与鉴定  30-47
    3.4.1 不同杂交组合苹果实生树不同发育阶段差异磷酸化蛋白表达  30-41
    3.4.2 不同杂交组合苹果实生树不同发育阶段差异磷酸化蛋白磷酸化位点的预测  41-47
  3.5 苹果实生树净光合速率的测定结果  47-48
第四章讨论  48-52
  4.1 苹果实生树在个体发育过程中蛋白质磷酸化修饰的差异  48-49
  4.2 碱性磷酸酶对蛋白进行去磷酸化  49-50
  4.3 S6PDH多克隆抗体对磷酸化修饰的初步鉴定  50
  4.4 光合作用与苹果实生树不同发育阶段蛋白质磷酸化修饰的关系研究  50-51
  4.5 磷酸化位点、磷酸化度与阶段转变的关系  51-52
第五章结论  52-53
参考文献  53-60
致谢  60-61
附录  61-97
个人简历  97

苹果实生树不同个体发育阶段蛋白质磷酸化差异修饰的研究

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