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大豆凝集素基因lec-s的克隆及转化烟草的研究

作　者: 郭佩佩
导　师: 高学文
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: lec-s基因转基因烟草抗病性抗虫性防卫基因
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

凝集素是具有一个或多个非催化性的结构域,可与单糖或多糖可逆结合的一类蛋白质或糖蛋白。目前为止,人们已经从多种植物、动物、细菌、病毒和真菌中分离出凝集素。迄今为止已发现的许多凝集素中,植物凝集素是最大的一个家族,尤以豆科植物的种子中凝集素含量最为丰富。以往的报道表明,植物凝集素在植物中具有防御功能。在正常情况下,植物凝集素仅作为储存蛋白而不表现任何特异活性；一旦植物受到微生物、昆虫等动物的危害,植物凝集素就会从植物的受害细胞释放出来,与病原物或昆虫消化道特定的糖蛋白结合,扰乱其正常的生理生化功能,最终表现为对病虫害的抗性。目前为止,已经有雪花莲凝集素基因、豌豆外源凝集素基因、菜豆凝集素基因、苋科凝集素基因以及Ⅱ型核糖体失活蛋白基因等许多植物凝集素基因成功地用于植物抗病虫害基因工程。在本实验室的前期工作中,我们利用RACE和反向PCR技术从大豆品种合丰29号中分离得到一个新的大豆凝集素基因,命名为lec-s (DQ235094).本研究旨在将编码大豆凝集素的基因lec-s转化烟草,以期提高烟草的抗病性和抗虫性,为将来该基因应用于植物病害的防治提供依据。通过RT-PCR方法,我们从大豆抗病品种合丰29号中克隆lec-s基因,将其插入入植物表达载体pBI121,构建植物表达载体pBI121::lec-s。重组载体转化至大肠杆菌DH5a中,经酶切、测序验证后,通过冻融法转化根癌农杆菌EHA105.菌落PCR和酶切检测后,挑选阳性克隆供转化烟草使用。采用根癌农杆菌EHA105介导的叶盘法,将重组表达质粒pBI121::lec-s转化烟草,获得了抗卡那霉素的转基因烟草植株。经PCR、Southern杂交和RT-PCR检测证明lec-s基因已整合到烟草基因组中,并且能在转录水平正常表达。抗TMV鉴定结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,与对照相比病斑减少了41.72%-43.79%,说明转基因烟草表现出对TMV的良好抗性。抗烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)的测定发现,转基因烟草强于未转化烟草和转空载体烟草。qRT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因(PR-la、GST1、Pal和hsr515)在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因诱导抗病防卫基因在植株体内的表达,增强了植株的系统抗性。此外转基因烟草对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的抗虫实验表明,大豆凝集素转基因烟草也表现良好的抗虫效果。与对照相比,喂食转基因烟草的甜菜夜蛾幼虫在取食2天后体重开始明显下降,且体重下降的情况一直持续到幼虫取食12天后。此外,喂食转基因烟草的甜菜夜蛾幼虫化蛹率也降至60%～73%。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
上篇文献综述  10-34
  第一章植物凝集素的研究进展  11-23
    1. 植物凝集素的种类  11-14
      1.1 根据植物凝集素亚基的结构特征分类  11
      1.2 根据结合糖的类型分类  11-12
      1.3 根据氨基酸序列的同源性及进化关系分类  12-14
    2. 植物凝集素的性质  14-15
      2.1 特异性糖结合活性  14-15
      2.2 稳定性  15
      2.3 结构特性  15
    3. 植物凝集素的生物学功能  15-19
      3.1 内源作用  15-17
      3.2 防卫作用  17-19
    4. 植物凝集素的应用  19-21
      4.1 在生物学研究中的应用  19-20
      4.2 在医学研究中的应用  20
      4.3 在植物病虫害防治中的应用  20-21
      4.4 在生物固氮中的作用  21
    5. 结语  21-23
  第二章植物抗病虫基因工程研究进展  23-34
    1. 植物基因转化受体系统  23-24
      1.1 愈伤组织再生系统  24
      1.2 直接分化再生系统  24
      1.3 原生质体再生系统  24
      1.4 生殖细胞受体系统  24
    2. 植物基因工程方法  24-26
      2.1 基于组织培养的遗传转化  24-26
      2.2 基于非组织培养的遗传转化  26
    3. 转化子细胞的筛选  26
      3.1 选择基因  26
      3.2 报告基因  26
    4. 植物抗病虫基因工程的主要目的基因  26-31
      4.1 抗虫基因  26-28
      4.2 抗病基因  28-31
    5. 植物抗病虫基因工程研究中的问题  31-34
      5.1 建立高频再生体系  32
      5.2 外源基因的稳定遗传  32
      5.3 病虫害对转基因植物的抗性  32
      5.4 转基因植物的潜在生态风险  32-34
下篇研究内容  34-81
  第一章植物表达载体的构建  35-51
    摘要  35-36
    1. 材料和方法  36-44
      1.1 材料  36
      1.2 方法  36-44
    2 结果与分析  44-48
      2.1 lec-s基因的克隆  44-45
      2.2 生物信息学分析  45-46
      2.3 表达载体的构建  46
      2.4 重组质粒的验证和转化  46-48
    3 讨论  48-50
    ABSTRACT  50-51
  第二章转lec-s基因烟草的产生和鉴定  51-67
    摘要  51
    1. 材料和方法  51-58
      1.1 材料  51-52
      1.2 方法  52-58
    2. 结果与分析  58-63
      2.1 转基因烟草的获得  58-59
      2.2 转基因烟草的PCR检测  59-60
      2.3 转基因烟草的Southern杂交鉴定  60-61
      2.4 转lec-s基因烟草的RT-PCR分析  61
      2.5 T1代转基因烟草种子抗性筛选实验  61-63
    3. 讨论  63-65
    ABSTRACT  65-67
  第三章转lec-s基因烟草的抗病虫性测定  67-81
    摘要  67-68
    1. 材料和方法  68-71
      1.1 转基因烟草的生长量测定  68
      1.2 T1代转基因烟草的抗TMV效果评价  68-69
      1.3 T1代转基因烟草的抗烟草疫霉效果评价  69
      1.4 实时定量RT-PCR测定转基因烟草防卫相关基因的表达情况  69-70
      1.5 转基因烟草对甜菜夜蛾的抗性实验  70-71
      1.6 数据分析  71
    2. 结果与分析  71-77
      2.1 转基因烟草生长量的测定  71-72
      2.2 转基因烟草对TMV的抗性表型鉴定  72-73
      2.3 T1代转基因烟草对烟草疫霉的抗性表型鉴定  73-74
      2.4 防卫相关基因的表达情况  74
      2.5 T1代转基因烟草对甜菜夜蛾的抗性鉴定  74-77
    3. 讨论  77-79
    ABSTRACT  79-81
参考文献  81-97
缩略语  97-99
附录  99-101
致谢  101-103
攻读硕士学位期间发表的论文  103

大豆凝集素基因lec-s的克隆及转化烟草的研究

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