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转AtMYB12基因提高马铃薯中绿原酸含量的研究

作　者: 代丽丽
导　师: 丁新华
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 马铃薯 ‘鲁引1号’ 转基因绿原酸抗氧化抑菌活性
分类号: S532
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

马铃薯是世界上重要的蔬菜作物和第四大粮食作物，属于茄科。‘鲁引1号’是山东省农科院由荷兰引进的马铃薯栽培品种，具有早熟、优质高产及适应性强等特点，在山东省内得到广泛的种植。绿原酸是一种多酚类物质，具有抗氧化、清除自由基，抑菌抗病毒和保护心血管等生物活性，马铃薯栽培品种中仅有少量的绿原酸存在，且不同品种之间差异性比较大。马铃薯是同源四倍体，应用杂交育种的方法改良品种比较困难。马铃薯可以通过块茎无性繁殖，将转基因特性传递给后代无需经过花培的纯化或多代的选育，因此利用基因工程技术培育新的品种有较大的优势。研究证明转录调控因子可以提高植物中次生代谢物的含量，随着分子生物学研究的不断深入，马铃薯遗传转化体系也日趋成熟。本研究通过高效液相色谱和质谱法检测到转AtMYB12基因的马铃薯‘Desiree’中绿原酸的含量明显提高，含量为1.095-4.846mg/g DW。通过农杆菌介导的马铃薯茎段转化法将拟南芥中的类黄酮调控因子AtMYB12基因转入马铃薯栽培品种‘鲁引1号’中。获得PCR阳性植株25株，阳性率32%。利用高效液相色谱测定马铃薯中绿原酸的含量，转基因马铃薯‘鲁引1号’块茎中绿原酸的含量为1.613-3.693mg/g DW，与非转基因相比含量提高近20倍。因转基因安全性问题备受争议，本研究中选用cre/lox位点特异性重组体系将转基因株系中的标记基因NPTII剔除掉，研究中选择了2个转基因株系进行了选择标记基因的剔除，对转基因植株进行β-雌二醇的诱导处理，β-雌二醇的浓度定为5μM，处理后经NPTIIF/R、CREF/R与AtMYB12F/R等特异性引物PCR分析，PCR结果表明β-雌二醇诱导产生NPTII重组缺失的概率为4%。无选择标记转基因AtMYB12的‘鲁引1号’块茎中绿原酸的含量为1.766-3.748mg/gDW，与非转基因马铃薯相比绿原酸含量有非常显著的提高，转基因块茎提取物的氧化抗性与对照相比提高2倍，抑菌试验证明转基因块茎提取物对大肠杆菌的抑制作用与非转基因块茎相比更加明显。对苯丙烷代谢途径上相关基因DFR、FLS和HQT的表达水平进行检测，三个基因的表达量均上升，转基因马铃薯中FLS基因的表达量与对照相比提高23倍； DFR基因的表达量提高17倍； HQT基因表达量提高的倍数最大，达到60倍。研究结果与预期相符，目标基因被完整的转入到马铃薯品种‘鲁引1号’中，且标记基因NPTII被剔除。综上所述，我们通过转基因的策略使得转基因马铃薯株系中绿原酸的含量提高，并使得转基因块茎提取物的氧化抗性及抑菌活性都得到了提高。本研究对提高马铃薯中绿原酸含量以及绿原酸在马铃薯中的合成通路的研究都提供了理论依据，并且有望通过转基因安全评估来服务生产，解决生产上的关键问题。

全文目录

符号说明  4-8
中文摘要  8-10
Abstract  10-12
1、引言  12-27
  1.1 马铃薯  12-13
    1.1.1 马铃薯基本情况介绍  12-13
    1.1.2 栽培品种‘鲁引 1 号’  13
  1.2 绿原酸的国内外研究现状  13-18
    1.2.1 绿原酸的结构与理化性质  13-14
    1.2.2 绿原酸的生物合成  14-15
    1.2.3 绿原酸的生物活性  15-17
      1.2.3.1 抗氧化与清除自由基  15-16
      1.2.3.2 抑菌与抗病毒作用  16
      1.2.3.3 降压、抗肿瘤、保护心血管的作用  16-17
    1.2.4 绿原酸研究价值  17-18
  1.3 转录因子与次生代谢  18-21
    1.3.1 转录因子对植物次生代谢的作用  18-19
    1.3.2 转录因子对植物次生代谢调节分子机制  19-20
      1.3.2.1 转录因子对植物次生代谢的调节  19
      1.3.2.2 转录因子对植物次生代谢调节的分子机制  19-20
    1.3.3 转录因子基因工程  20-21
      1.3.3.1 植物次生代谢遗传改良的意义  20
      1.3.3.2 MYB 转录因子  20-21
  1.4 马铃薯转基因研究现状  21-23
    1.4.1 我国的马铃薯育种技术和方法  21-22
    1.4.2 马铃薯转基因育种  22-23
  1.5 无选择标记基因的转基因研究  23-26
    1.5.1 无选择标记转基因体系的探讨  23-25
    1.5.2 Cre／lox 位点特异性重组系统概述  25-26
  1.6 本研究的内容与目的意义  26-27
2.材料与方法  27-36
  2.1 实验材料  27
    2.1.1 供试植物  27
    2.1.2 菌株和质粒  27
    2.1.3 常用缓冲液及培养基的配制  27
  2.2 方法  27-36
    2.2.1 转基因马铃薯‘Desiree’中绿原酸含量的测定  27-28
      2.2.1.1 HPLC 定量分析  27-28
      2.2.1.2 质谱定性分析  28
    2.2.2 ‘鲁引 1 号’马铃薯转基因体系的建立  28-31
      2.2.2.1 提取农杆菌质粒  28-29
      2.2.2.2 农杆菌质粒的 PCR 检测  29-30
      2.2.2.3 农杆菌介导的茎段转化法转化马铃薯  30
      2.2.2.4 阳性植株的检测  30-31
    2.2.3 ‘鲁引 1 号’转基因马铃薯中绿原酸含量的测定  31
      2.2.3.1 高效液相色谱测定转基因马铃薯块茎中绿原酸的含量  31
    2.2.4 无选择标记马铃薯‘鲁引 1 号’植株的获得及阳性植株的分子检测  31-33
      2.2.4.1 再生植株 NPTII 基因的去除，无选择标记植株的再生  31-32
      2.2.4.2 无选择标记植株的 PCR 检测  32-33
    2.2.5 无选择标记转基因马铃薯‘鲁引 1 号’中绿原酸含量的研究  33-36
      2.2.5.1 高效液相色谱测定转基因马铃薯‘鲁引 1 号’薯块中绿原酸的含量  33
      2.2.5.2 转基因马铃薯‘鲁引 1 号’抗氧化性的检测  33-34
      2.2.5.3 转基因马铃薯块茎提取物抑菌活性检测  34
      2.2.5.4 转基因植株基因表达量鉴定  34-36
3.结果与分析  36-48
  3.1 转 AtMYB12 基因马铃薯‘Desiree’中绿原酸定性定量分析  36-39
    3.1.1 转基因马铃薯中绿原酸物质的定量测定  36-37
    3.1.2 转基因马铃薯‘Desiree’中绿原酸物质的定性分析  37-39
  3.2 ‘鲁引 1 号’马铃薯转基因体系的建立  39-41
    3.2.1 马铃薯‘鲁引 1 号’的遗传转化  39-40
    3.2.2 转 AtMYB12 基因马铃薯‘鲁引 1 号’阳性植株的检测  40-41
  3.3 转基因马铃薯‘鲁引 1 号’中绿原酸含量检测  41-42
  3.4 无选择标记转基因马铃薯‘鲁引 1 号’植株的获得  42-44
    3.4.1 马铃薯组织培养过程中剔除选择标记基因  42-43
    3.4.2 转基因马铃薯中选择标记基因剔除的 PCR 鉴定  43-44
  3.5 无选择标记转基因马铃薯‘鲁引 1 号’中绿原酸含量的研究  44-46
    3.5.1 目标基因的功能  44-45
    3.5.2 转基因马铃薯‘鲁引 1 号’氧化抗性的检测  45-46
    3.5.3 抑菌活性检测  46
  3.6 基因表达量检测  46-48
4、讨论  48-50
  4.1 AtMYB12 在马铃薯中激活咖啡酰奎尼酸的通路  48-49
  4.2 转基因马铃薯中绿原酸的生物活性的探讨  49-50
  4.3 材料选择的创新性  50
  4.4 有待进一步研究的问题  50
5、结论  50-52
参考文献  52-58
附录Ⅰ 常用缓冲液及培养基的配制  58-60
附录Ⅱ 常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器  60-62
致谢  62-63
攻读学位期间发表论文情况  63

转AtMYB12基因提高马铃薯中绿原酸含量的研究

内容摘要

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