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一对等位WRKY类转录因子基因在水稻抗病反应中的功能分析

作　者: 陶增
导　师: 王石平
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻 非生物胁迫 抗病相关基因 OsWRKY45 等位基因
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


稻瘟病,白叶枯病和细条病等水稻病害是限制水稻生产的重要因素之一,研究水稻的抗病性对水稻抗病育种具有重要意义。鉴定水稻抗病相关基因,丰富了水稻抗病的基因资源,为培育广谱且持久抗性的水稻品种提供了新途径,也深化了对水稻抗病机理的理解。本研究通过运用植物功能基因组学的各种研究手段,研究了一个水稻WRKY类转录因子基因及其等位基因在水稻抗病反应与非生物胁迫反应中的主要功能。OsWRKY是水稻抗病反应的正调控因子,超量表达OsWRKY13同时增强了水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性,OsWRKY13可以与OsWRKY45的启动子互作,超量表达OsWRKY13抑制了OsWRKY45的表达,而抑制OsWRKY13可以增强OsWRKY45的表达。根据前人的研究,OsWRKY45在苯丙噻二唑介导的水稻抗稻瘟病反应中起着重要作用,超量表达OsWRKY45极大的增强了水稻对稻瘟病的抗性,抑制OsWRKY45的表达减弱了抗性。本研究对不同基因组的OsWRKY45基因进行扩增,发现来自粳稻的OsWRKY45基因序列一致,命名为OsWRKY45-1,编码326个氨基酸；来自籼稻的OsWRKY45基因序列一致,命名为OsWRKY45-2,编码322个氨基酸。两个等位基因在启动子,编码区和蛋白质上都存在较大差异。利用农杆菌介导的遗传转化的方法,在感病的粳稻品种牡丹江8中分别超量表达OsWRKY45-1和OsWRKY45-2,在籼稻品种明恢63(携带OsWRKY45-2)中采用RNA干扰技术(RNA interference, RNAi)抑制OsWRKY45-2的表达,分别得到转化植株。同时我们得到OsWRKY45-1的T-DNA插入突变体,纯合植株中OsWRKY45-1的表达完全沉默。白叶枯病菌接种及共分离分析表明,OsWRKY45-1是水稻抗白叶枯病反应的负调控因子,超量表达OsWRKY45-1减弱了水稻对白叶枯病菌的抗性,OsWRKY45-1的T-DNA插入突变体增强了对白叶枯病菌的抗性。与此相反,OsWRKY45-2是水稻抗白叶枯病反应的正调控因子,超量表达OsWRKY45-2极大的增强对白叶枯病的抗性,RNAi抑制OsWRKY45-2的表达减弱了抗性。同时抗谱接种表明,OsWRKY45-1和OsWRKY45-1介导的抗病反应无小种的特异性。转基因植株对另一种细菌性病原,细菌性条斑病也表现相同趋势的抗性反应,OsWRKY45-1和OsWRKY45-2扮演了相反的调控角色。然而,OsWRKY45-1和OsWRKY45-2在抗稻瘟病反应中表现相似的表型,超量表达OsWRKY45-1和OsWRKY45-2都不同程度的增强了植株对稻瘟病的抗性。采用定量RT-PCR的方法检测上述转基因植株在接种白叶枯病前后一些抗病应答基因的表达情况,结果表明,OsWRKY45-1负调控PR1a,PR1b,AOS2,LOX, PAL1,NH1和OsWRKY13的表达,而OsWRKY45-2则正调控PR1a,PR1b,AOS2, LOX,PAL1和OsWRKY13的表达,对NH1没有影响。对转基因植株体内的激素信号分子水杨酸和茉莉酸的含量测定表明,超量表达OsWRKY45-1的植株中水杨酸和茉莉酸的含量都呈不同程度的降低,突变体中相应的都有所增加；而超量表达OsWRKY45-2的植株中则积累了更多的茉莉酸,水杨酸的含量无明显改变。因此,我们认为OsWRKY45-1和OsWRKY45-2在体内以不同的调控角色参与水稻抗白叶枯病的反应,可能是由于相反的调控了这些下游的应答基因,以及水杨酸和茉莉酸信号途径引起。等位基因OsWRKY45-1和OsWRKY45-2不仅参与水稻抗病反应,还参与了水稻的非生物胁迫反应。在水稻应答脱落酸,干旱,高盐和冷害的过程中,等位基因OsWRKY45-1和OsWRKY45-2表现不同或相似的表达模式。OsWRKY45-1和OsWRKY45-2转基因植株对脱落酸的胁迫表现相反趋势的敏感性,超量表达OsWRKY45-1的转基因植株对脱落酸表现更不敏感且植株中脱落酸的含量上升,而超量表达OsWRKY45-2表现更加敏感且脱落酸的含量下降；超量表达OsWRKY45-1和OsWRKY45-2的转基因植株都表现对冷害的超常敏感,相应的OsWRKY45-1的突变体对冷害的耐性增强；同时转基因植株对高盐和干旱的胁迫与对照相比无明显变化。为了深入解析OsWRKY45-1和OsWRKY45-2功能及调控基因的差异,我们对其转基因植株进行全基因组芯片分析。作为等位基因两者既共同调控一些基因的上调和下调,也分别特异的调控了一些基因的差异表达,还要一些基因在OsWRKY45-1和OsWRKY45-2之间表现出相反的调控模式,意味着两者功能上的异同可能和这些差异表达基因存在某种联系。我们关注了两者超量表达植株中共同下调的基因里出现了大量的逆境相关基因,很多基因受冷害的诱导表达,与转基因植株在冷害中的表型相符合。用定量RT-PCR的方法对此类基因进行验证,结果显示这些基因在超量表达材料里确实呈不同程度的下降,与芯片结果相符。综上,OsWRKY45等位基因在不同的生理活动中可能由于相似或相反的调控某些基因,通过影响不同的信号分子而担任相同或相反的角色。究竟哪些因素造成了两者在体内功能上的异同,还有待进一步的实验证明。

全文目录


中文摘要  7-10
Abstract  10-13
1 前言  13-36
  1.1 植物抵抗各种生物逆境的反应  13-15
  1.2 植物抗病反应的信号传导途径  15-21
    1.2.1 植物先天免疫反应  15-17
    1.2.2 R基因介导的抗病反应  17-18
    1.2.3 水杨酸及其介导的系统性获得抗性  18-20
    1.2.4 茉莉酸与乙烯及其介导的诱导系统抗性  20-21
  1.3 植物抗病信号途径的复杂性  21-22
  1.4 植物抵抗非生物逆境的反应  22-25
  1.5 水稻抗病反应  25-27
    1.5.1 几种主要的水稻病害  25-26
    1.5.2 水稻抗病性研究进展  26-27
  1.6 WRKY类转录因子研究进展  27-34
    1.6.1 WRKY类转录因子结构与分类  28-29
    1.6.2 WRKY类转录因子的生物学功能  29-31
    1.6.3 WRKY转录因子的调控方式  31-33
    1.6.4 水稻WRKY类转录因子研究概况  33-34
  1.7 研究目的和意义  34-36
2 材料与方法  36-48
  2.1 水稻材料与基因来源  36-37
    2.1.1 水稻材料与来源  36
    2.1.2 OsWRKY45基因的克隆与分离及等位基因验证  36-37
    2.1.3 用于表达分析的抗病相关基因  37
  2.2 载体构建及农杆菌介导的遗传转化  37-42
    2.2.1 OsWRKY45超量表达载体构建  37
    2.2.2 OsWRKY45-2 RNAi双链抑制表达载体构建  37-42
    2.2.3 农杆菌介导的遗传转化  42
  2.3 病原物接种及病情调查  42-44
    2.3.1 白叶枯病接种与调查  42-43
    2.3.2 稻瘟病接种与调查  43
    2.3.3 细条病接种与调查  43-44
  2.4 非生物胁迫处理  44-45
    2.4.1 转基因植株对脱落酸敏感性分析  44
    2.4.2 转基因植株苗期耐盐性分析  44
    2.4.3 转基因植株苗期抗旱性分析  44
    2.4.4 转基因植株苗期耐冷性分析  44-45
  2.5 核酸操作及分子杂交分析  45
    2.5.1 DNA抽提  45
    2.5.2 RNA抽提  45
    2.5.3 RT-PCR和定量RT-PCR分析  45
  2.6 染色质免疫共沉淀  45-46
  2.7 水稻内源激素测定  46
  2.8 序列测定与分析  46-48
3 结果与分析  48-86
  3.1 OsWRKY45基因结构与特性  48-57
    3.1.1 OsWRKY45-1和OsWRKY45-2基因的分离克隆与结构分析  48-50
    3.1.2 OsWRKY45-1和OsWRKY45-2启动子结构分析  50-52
    3.1.3 OsWRKY45-1和OsWRKY45-2在生物胁迫和非生物胁迫下的表达模式分析  52-54
    3.1.4 OsWRKY45与抗病QTL的关系  54
    3.1.5 OsWRKY13蛋白可以与OsWRKY45-1和OsWRKY45-2的启动子结合  54-57
  3.2 OsWRKY45介导水稻对生物胁迫的反应  57-69
    3.2.1 OsWRKY45介导水稻对白叶枯病的抗性  57-66
    3.2.2 OsWRKY45介导水稻对细菌性条斑病的抗性  66
    3.2.3 OsWRKY45介导水稻对稻瘟病的抗性  66-69
  3.3 OsWRKY45对抗病相关基因表达的影响  69-71
  3.4 转基因植株内源水杨酸和茉莉酸含量分析  71-72
  3.5 OsWRKY45介导转基因水稻对非生物胁迫的反应  72-80
    3.5.1 OsWRKY45介导水稻对脱落酸的反应  72-75
      3.5.1.1 脱落酸对OsWRKY45转基因植株种子的敏感性分析  73
      3.5.1.2 脱落酸对OsWRKY45转基因植株幼苗生长的敏感性分析  73-75
    3.5.2 OsWRKY45介导水稻对低温的反应  75-77
    3.5.3 OsWRKY45介导水稻对高盐的反应  77-78
    3.5.4 OsWRKY45介导水稻对干旱的反应  78
    3.5.5 OsWRKY45转基因植株中脱落酸含量的测定  78-80
  3.6 全基因组芯片分析  80-86
    3.6.1 差异表达基因  80-84
    3.6.2 差异表达基因在转基因植株体内的验证  84-86
4 讨论  86-93
  4.1 OsWRKY45-1和OsWRKY45-2以相反的角色参与调控水稻抗白叶枯病反应  86-88
  4.2 OsWRKY45和OsWRKY13在体内存在复杂的相互调控关系  88-89
  4.3 水稻可以通过多个途径调控对白叶枯病和稻瘟病的抗性反应  89
  4.4 OsWRKY45在脱落酸和耐冷性信号中起重要作用  89-90
  4.5 OsWRKY45-1和OsWRKY45-2的功能差异由什么因素造成  90-91
  4.6 OsWRKY45-1和OsWRKY45-2介导水稻生物胁迫与非生物胁迫的交叉反应  91-93
5 参考文献  93-111
附录  111-129
作者简介  129-130
致谢  130-131

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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