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水稻中两个MAPKKK基因的功能鉴定

作　者: 宁婧
导　师: 熊立仲
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 水稻 MAPKKK 非生物胁迫叶夹角
分类号: S511
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

水稻是禾谷类作物功能基因组学研究的模式植物,也是世界上最重要的粮食作物之一。MAPK级联(即MAPKKK-MAPKK-MAPK的顺次磷酸化)信号途径在植物的胁迫反应和发育过程中都起着重要的作用,但在水稻中经过功能鉴定的MAPK级联信号途径上的基因还非常少。本研究首先鉴定了一个干旱敏感水稻T-DNA插入突变体(dsm1)和一个叶夹角增大水稻T-DNA插入突变体(ila1)。这两个突变体对应的突变基因DSMl和ILA1都编码水稻Raf类MAPKKK。本研究进而对这两个突变体和基因的功能进行了深入的分析。主要结果如下：dsm1的两个等位突变体在苗期和成株期都对干旱敏感,并且失水速率快于野生型。DSM1 RNAi抑制表达转基因植株也是干旱敏感的表型。DSM1属于Raf类MAPKKK B3亚家族,是核定位蛋白。激酶活性实验表明DSM1激酶区能磷酸化MBP,并且有自磷酸化的活性。DSM1的表达受旱、盐和ABA诱导,但不受冷胁迫诱导。芯片数据揭示两个过氧化物酶基因(POX22.3和POX8.1)在突变体中的表达量显著低于野生型,这暗示了DSM1可能参与ROS信号途径。过氧化物酶活性、电解液渗透、叶绿素含量和DAB染色表明dsml对氧化胁迫敏感是由过氧化物酶活性下降,清除ROS能力降低所造成的。DSM1超量表达植株一定程度上增强对甘露醇胁迫的抗性。ila1在分蘖期和抽穗期的叶夹角明显大于野生型。ILA1基因组序列能恢复突变体表型。切片结果显示ILA1可能参与厚壁细胞发育。ILA1也属于Raf类MAPKKK,是核定位蛋白,并且在叶枕处特异表达。激酶活性实验表明,有MBP时ILA1有自磷酸化活性和很强的磷酸化MBP的活性。通过酵母双杂交,筛选到6个ILA1互作蛋白,命名为IIP蛋白。这6个IIP蛋白功能未知且属于同一家族。通过BiFC证明ILA1与IIP2和IIP4互作,通过Co-IP证明了ILA1与IIP4互作。IIP2和IIP4也是核定位蛋白,并且在酵母中有转录激活活性,表明它们可能是新的转录因子。

全文目录

缩写名词表  7-8
摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-25
  1.1 植物逆境应答和信号传导的一般途径  11-12
  1.2 MAPK级联信号通路  12-21
    1.2.1 MAPK级联信号通路的发现  13-14
    1.2.2 MAPK级联信号通路的成员  14-17
    1.2.3 MAPK级联信号通路在植物中的功能  17-21
      1.2.3.1 MAPK级联信号通路与细胞分裂  17-18
      1.2.3.2 MAPK级联信号通路与植物激素  18-19
      1.2.3.3 MAPK级联信号通路与非生物胁迫和生物胁迫  19-21
  1.3 植物中其它几种信号传导途径  21-24
    1.3.1 CDPK信号传导途径  21-22
    1.3.2 CBL-CIPK信号传导途径  22-24
  1.4 影响植物叶夹角的因素  24-25
  1.5 本研究的目的和意义  25
2 材料与方法  25-35
  2.1 水稻材料  25
  2.2 菌株和载体  25-26
  2.3 突变体的基因型检测  26-27
  2.4 水稻苗期材料的逆境胁迫  27-28
  2.5 RNA抽提、反转录、RT-PCR和Real-time PCR  28-29
  2.6 载体构建及遗传转化  29-30
  2.7 突变体及转基因植株抗逆性分析  30-31
  2.8 GUS组织化学染色  31
  2.9 目标蛋白的亚细胞定位  31-32
  2.10 蛋白抽提及Western blot  32
  2.11 免疫沉淀及磷酸化  32
  2.12 氧化胁迫相关生理指标  32-33
  2.13 目标蛋白在酵母中的转录活性  33
  2.14 酵母双杂交  33
  2.15 Coimmunoprecipitation (Co-IP)  33-34
  2.16 Bimolecular fluorescence complementation (BiFC)  34-35
3 结果与分析  35-85
  3.1 水稻MAPKKK家族分析和突变体表型筛选  35-37
  3.2 DSM1基因的突变体表型和功能分析  37-65
    3.2.1 dsm1-1突变体的获得及鉴定  37-38
    3.2.2 dsm1-1突变体抗逆性分析  38-42
    3.2.3 等位突变体dsm1-2的获得及表型鉴定  42-43
    3.2.4 DSM1抑制表达转基因植株表型分析  43-45
    3.2.5 DSM1的表达模式和亚细胞定位  45-48
    3.2.6 DSM1是一个Raf-like MAPKKK  48-53
    3.2.7 dsm1-1中基因表达变化的芯片分析  53-59
    3.2.8 DSM1调节水稻ROS的清除能力  59-62
    3.2.9 DSM1超表达转基因植株抗旱性分析  62-64
    3.2.10 DSM1在酵母中有转录激活活性及其互作蛋白研究  64-65
  3.3 ILA1基因的突变体表型和功能分析  65-85
    3.3.1 ila1突变体的获得及鉴定  65-67
    3.3.2 ila1突变体的表型观察  67-69
    3.3.3 ila1突变体的功能互补  69
    3.3.4 ILA1的表达模式和亚细胞定位  69-70
    3.3.5 徒手切片观察ila1叶枕  70-71
    3.3.6 ILA1是一个Raf类MAPKKK  71-75
    3.3.7 ILA1筛选酵母双杂交文库  75-80
    3.3.8 ILA1与IIP2、IIP4在体内互作  80-83
    3.3.9 ILA1互作蛋白功能的初步研究  83-85
4 讨论  85-90
  4.1 DSM1基因功能的探讨  85-88
  4.2 ILA1基因功能的探讨  88-90
参考文献  90-99
附录  99-129
  附录Ⅰ.部分实验的详细操作程序  99-104
  附录Ⅱ.DSM1芯片数据  104-127
  附录Ⅲ.作者简介  127-129
致谢  129

水稻中两个MAPKKK基因的功能鉴定

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