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携氧剂对有效霉素A生物合成的影响及其机制探索

作　者: 冯劲松
导　师: 郑晓冬
学　校: 浙江大学
专　业: 发酵工程
关键词: 有效霉素A 携氧剂 氨基酸 快速检测 基因表达
分类号: S482.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


有效霉素A是一种重要的农用抗生素,作为由好氧菌分泌的次级代谢产物,培养基中溶解氧浓度对其发酵产量的影响尤为显著。携氧剂作为一类具有高溶解氧能力的化合物,可以显著提升环境中氧气传递速率,其作用已在很多发酵实验中得以验证。有效霉素A的价值在农业领域已经得到了充分体现,对其产量需求逐年升高,因此如何有效提高其发酵产量便成为了研究的热点。有报道证明提高发酵环境中氧化压力可以促进有效霉素A的生物合成,但目前却没有有效的方法可以应用于实际生产,而且对携氧剂影响发酵过程的机理探索也不够深入。本研究以吸水链霉菌5008为发酵菌种,通过添加携氧剂引入了一种新型的发酵策略,经过对携氧剂种类与添加量的筛选,发现加入0.01%(v/v)液体石蜡对有效霉素A产量的促进效果最为明显；对发酵参数的测定发现液体石蜡会在对数期加快菌体生长速率与糖利用率,推测液体石蜡提高效霉素A产量的作用是通过激活菌内代谢调节实现。结合到携氧剂的特性,我们对胞内氧化压力水平进行了检测,发现由液体石蜡诱导产生的活性氧物质是激活这一调节作用的重要因素。在感受氧化环境变化方面,氧化态感受全局调控子以及有效霉素A的合成基因均作出响应的上调表达,此外主要碳代谢途径在次级代谢阶段,也明显的由糖酵解途径转向了有利于有效霉素A前体积累的磷酸戊糖途径。这些结果在基因水平和酶活水平上全面解释了有效霉素A产量提高的原因。在发酵过程中我们发现,有效霉素A伴生色素的吸光值与有效霉素A的产量之间存在稳定且密切关系。通过对两者关系进行拟合,我们建立了一种准确且稳定的有效霉素A快速检测法。此外我们又对另一种对有效霉素A产量有潜在影响的生物小分子-氨基酸对发酵作用进行了验证,证实发酵过程中氮源种类的不同也会影响有效霉素A的生物合成。最后,在5L发酵罐模拟了液体石蜡添加发酵在生产环境中的影响效果,证实添加液体石蜡是一种促进有效霉素A产量的有效的发酵策略。

全文目录


致谢  6-7
摘要  7-8
Abstract  8-10
目录  10-16
第一章 研究背景综述  16-25
  1.1 有效霉素的发现与组分  16-17
  1.2 有效霉素A的抗菌机理及应用  17-19
    1.2.1 有效霉素A的抗菌机理  17-18
    1.2.2 有效霉素A的应用  18-19
  1.3 有效霉素A生物合成的研究  19-20
    1.3.1 有效霉素A生物合成途径的研究  19
    1.3.2 有效霉素A合成基因的研究  19-20
    1.3.3 有效霉素A的合成调控研究  20
  1.4 有效霉素A生产研究进展  20-22
  1.5 携氧剂对抗生素发酵的影响  22-23
    1.5.1 携氧剂的特点与作用  22
    1.5.2 携氧剂在发酵过程中的应用  22-23
  1.6 研究的内容与意义  23-25
    1.6.1 研究的内容  23-24
    1.6.2 研究的意义  24-25
第二章 携氧剂对有效霉素A发酵过程的影响  25-35
  2.1 材料与仪器  25-26
    2.1.1 菌种  25
    2.1.2 主要试剂  25
    2.1.3 主要仪器  25-26
  2.2 实验步骤与方法  26-28
    2.2.1 培养基与溶液配制  26-27
    2.2.2 发酵细胞生长量的测定  27
    2.2.3 发酵液pH和残糖量的测定  27-28
    2.2.4 有效霉素A的测定  28
  2.3 实验结果  28-33
    2.3.1 有效霉素A产量变化  28-29
    2.3.2 菌体生长变化  29-31
    2.3.3 发酵过程中pH变化  31
    2.3.4 发酵过程中残糖量变化  31-33
  2.4 讨论  33-35
第三章 液体石蜡对发酵过程中活性氧物质产生的影响  35-44
  3.1 材料与仪器  35-37
    3.1.1 菌体与发酵条件  35
    3.1.2 主要试剂  35-36
    3.1.3 溶液配制  36
    3.1.4 主要仪器  36-37
  3.2 实验方法  37-40
    3.2.1 细胞内过氧化氢酶合成基因表达的测定  37-39
    3.2.2 细胞内过氧化氢酶活性的测定  39-40
      3.2.2.1 粗酶液的制备  39
      3.2.2.2 过氧化氢酶活性的测定  39-40
  3.3 实验结果  40-44
    3.3.1 细胞内过氧化氢酶合成基因表达的测定  40-41
    3.3.2 细胞内过氧化氢酶活性的测定  41-44
第四章 液体石蜡对代谢基因表达的影响  44-53
  4.1 材料与仪器  44-45
    4.1.1 菌体与发酵条件  44
    4.1.2 主要试剂  44
    4.1.3 溶液配制  44-45
    4.1.4 主要仪器  45
  4.2 实验方法  45-49
    4.2.1 引物设计  45-46
    4.2.2 RNA的提取与反转录  46
    4.2.3 扩增条件与溶解曲线  46-49
  4.3 实验结果与讨论  49-53
    4.3.1 次级代谢调控基因的表达水平  49-50
    4.3.2 有效霉素A结构及其合成相关基因的表达水平  50-53
第五章 液体石蜡对代谢途径中相关酶的活性影响  53-61
  5.1 材料与仪器  53-55
    5.1.1 菌种  53
    5.1.2 主要仪器  53
    5.1.3 溶液配制  53-55
  5.2 实验方法  55-57
    5.2.1 粗酶液的制备  55
    5.2.2 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)活力测定方法  55-56
    5.2.3 三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活力测定方法  56-57
  5.3 实验结果与分析  57-59
    5.3.1 G6PD活力测定结果  57-58
    5.3.2 GAPDH活力测定结果  58-59
  5.4 总结与讨论  59-61
第六章 有效霉素A的吸光值快速检测法  61-69
  6.1 材料与仪器  61-62
    6.1.1 菌种与培养方法  61
    6.1.2 主要试剂  61-62
    6.1.3 主要仪器  62
  6.2 实验步骤与方法  62
    6.2.1 培养基与溶液配制  62
    6.2.2 有效霉素A的测定  62
    6.2.3 发酵培养液中色素吸光值的测定  62
  6.3 实验结果  62-68
    6.3.1 有效霉素A产量与色素分泌之间的关系  62-64
    6.3.2 有效霉素A伴生色素的稳定性检测  64
    6.3.3 拟合曲线的确定  64-66
    6.3.4 吸光值法快速检验法的适用性分析  66-68
  6.4 实验结论  68-69
第七章 小型发酵罐中添加液体石蜡的有效霉素A发酵探索  69-75
  7.1 材料与仪器  69-70
    7.1.1 菌种与培养方法  69-70
    7.1.2 主要试剂  70
    7.1.3 主要仪器  70
  7.2 实验步骤与方法  70-71
    7.2.1 培养基与溶液配制  70
    7.2.2 有效霉素A的测定  70-71
    7.2.3 细胞生长量和残糖量的测定  71
    7.2.4 发酵过程中溶解氧与pH的测定  71
  7.3 实验结果与讨论  71-75
    7.3.1 发酵参数的测定  71-72
    7.3.2 液体石蜡对产量的影响  72-73
    7.3.3 液体石蜡对菌体生长和残糖利用率的影响  73-75
第八章 其他影响因子的作用探索  75-82
  8.1 材料与仪器  75-76
    8.1.1 菌种  75
    8.1.2 主要试剂  75-76
    8.1.3 主要仪器  76
  8.2 实验步骤与方法  76-77
    8.2.1 培养基与溶液配制  76
    8.2.2 发酵细胞生长量的测定  76
    8.2.3 残糖量的测定  76-77
    8.2.4 有效霉素A的测定  77
    8.2.5 6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PD)活力测定方法  77
    8.2.6 三磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)活力测定方法  77
  8.3 实验结果  77-81
    8.3.1 氨基酸最适添加浓度筛选及其对有效霉素A产量的影响  77-79
    8.3.2 氨基酸对菌体生长和糖利用的影响  79
    8.3.3 氨基酸对菌体碳代谢的影响  79-81
  8.4 实验结论  81-82
第九章 结论与展望  82-85
  9.1 研究结论  82-83
  9.2 研究展望  83-85
    9.2.1 更全面的研究活性氧影响作用  83-84
    9.2.2 在生产规模中液体石蜡添加发酵的探索与条件优化  84
    9.2.3 伴生色素的分离与鉴定  84-85
参考文献  85-91

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 农药防治（化学防治） > 各种农药 > 杀菌剂
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