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柑橘与溃疡病菌互作相关基因的克隆及表达分析

作　者: 黄龙
导　师: 邓子牛
学　校: 湖南农业大学
专　业: 果树学
关键词: 柑橘溃疡病致病因子PthA 病原-寄主互作基因基因表达分析
分类号: S436.661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

柑橘溃疡病是一种危害严重的检疫性病害,虽然发现上百年了,但对于该病的致病机理和抗病机理知之甚少。本文对柑橘与溃疡病菌有互作关系的几个基因进行了克隆,并分析了他们在接种溃疡病菌后的表达情况,得出如下结果：1.利用PthA-nls单克隆抗体,通过免疫共沉淀的方法在感病寄主体内找到一个可能与PthA有互作关系的靶标蛋白,经过质谱鉴定后命名为CsSRP54。通过同源克隆的方法,在感病的冰糖橙和抗病的枸橼C05上克隆得到该靶标蛋白的基因srp54,同时也克隆了国外报道的类似靶标基因imp-α,分析了感病和抗病柑橘的这两个基因全长和cDNA序列的结构差异。结果显示冰糖橙和枸橼的srp54的基因组DNA同源性高达98.5%,cDNA同源性99.6%；imp-α的基因组DNA的同源性98.6%,cDNA的同源性98.9%。同时,冰糖橙和枸橼的srp54翻译成氨基酸后的同源性有98.58%；imp-a翻译成氨基酸的同源性有99.44%。结果说明感病柑橘和抗病柑橘在病原菌致病因子的绑定蛋白的结构上没有明显差异。2.溃疡病菌入侵寄主后,需在寄主细胞间隙繁殖,属于寄主与病原互作的第一个阶段,在该过程中可以诱发病原相关分子模型诱导的免疫(PTI)。在转录组分析的结果中,发现了一些在感病材料与抗病材料表达量相反的基因,即在一个材料里面是表达上升的,在另一个材料里面是表达下降,以及在感病材料或者抗病材料表达特别显著的基因,其中cerk1是一个在细胞间隙的具有抑制细菌繁殖功能的基因,起到PTI的作用。这些分析为后续的抗病基因的挖掘打下基础。3.为了验证克隆的srp54和imp-α互作基因及在转录组中获得的cerkl基因与溃疡病菌的关系,对各基因在感病的冰糖橙和抗病的枸橼C05接种溃疡病菌后不同时期的表达量进行了动态分析。结果表明冰糖橙的srp54基因在接种溃疡病菌后立即上调表达,在接种后第9天,达到最高；同时imp-α基因在冰糖橙接种后第3天也明显上调表达,但随后逐渐减弱,接种9天后基本平稳；而枸橼C05在整个接种观察期间,两个基因的表达保持在较低水平。第9天时冰糖橙已表现出典型症状,枸橼C05仍然没有表现典型症状,这两个基因可能与冰糖橙的致病有关。冰糖橙cerkl基因在接种后3天明显下调,随后一直维持较低表达水平；而枸橼则在接种后3-6天一直上调明显表达,随后恢复到低表达水平。cerk1基因具有抑制病原菌入侵初期在寄主繁育的作用,说明枸橼C05在感染初期具有在细胞间隙抑制溃疡病菌繁殖的能力,而冰糖橙因为该基因下调表达,不能抑制溃疡病菌的繁殖而感病。研究结果为探明溃疡病的致病和抗病机理打下基础。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-11
第一章前言  11-17
  1 柑橘溃疡病菌的侵染过程  11-12
  2 溃疡病菌致病因子的研究进展  12-14
    2.1 PthA/AvrBs家族基因的特征  12
    2.2 PthA/AvrBs家族基因的作用机理  12-14
  3 病原菌致病效应子与寄主靶标蛋白互作的研究  14-16
    3.1 病原菌致病效应子的作用  14
    3.2 病原效应子的挖掘  14-15
    3.3 寄主的效应子靶标蛋白的鉴定  15
    3.4 靶标蛋白的功能探寻  15-16
  4 研究目的及意义  16-17
第二章柑橘溃疡病菌致病因子PthA互作蛋白的获得  17-26
  1 材料与方法  17-21
    1.1 柑橘溃疡病菌分离和纯化  17-19
    1.2 接种  19
    1.3 叶片可溶性蛋白质的提取  19-20
    1.4 免疫共沉淀  20-21
    1.5 差异蛋白的质谱分析  21
  2 结果与分析  21-23
    2.1 注射接种后溃疡病症状的观察  21
    2.2 蛋白质定量与电泳分离  21-23
    2.3 特异蛋白质的质谱鉴定  23
  3 讨论  23-25
  4 小结  25-26
第三章与致病因子PthA互作基因的克隆与鉴定  26-35
  1 材料与方法  26-29
    1.1 DNA提取  26-27
    1.2 RNA提取  27
    1.3 引物的设计  27-28
    1.4 基因的cDNA全长克隆  28-29
    1.5 基因的genomic DNA全长克隆  29
    1.6 测序  29
  2 结果与分析  29-33
    2.1 srp54和imp-a基因的扩增与克隆  29-31
    2.2 srp54和imp-a的cDNA测序  31
    2.3 srp54和imp-a的genomic DNA测序  31-32
    2.4 冰糖橙和枸橼srp54和imp-a基因氨基酸的二级结构预测  32-33
  3 讨论  33-34
  4 小结  34-35
第四章柑橘与溃疡病菌互作相关基因的表达分析  35-49
  1 材料与方法  35-38
    1.1 柑橘转录组差异表达基因的分析  35-36
    1.2 溃疡病菌液的制备  36
    1.3 溃疡病菌的接种  36
    1.4 叶片样品的采集  36
    1.5 样品RNA的提取  36-37
    1.6 cDNA的合成  37
    1.7 引物的设计  37-38
    1.8 荧光定量PCR分析  38
  2 结果与分析  38-47
    2.1 转录组表达差异基因的分析  38-43
    2.2 针刺接种后病情的观察  43-44
    2.3 srp54基因的表达分析  44-45
    2.4 imp-α基因的表达分析  45-46
    2.5 CERK1基因的表达分析  46-47
  3 讨论  47-48
  4 小结  48-49
总结与展望创新点  49-50
下一步工作设想  50-51
参考文献  51-56
附录：缩略词表  56-57
冰糖橙和枸橼srp54和imp-α的测序结果  57-66
冰糖橙和枸橼srp54和imp-α比对结果  66-72
致谢  72-73
个人简介  73

柑橘与溃疡病菌互作相关基因的克隆及表达分析

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