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番茄根际灰霉病拮抗菌的筛选和遗传多样性研究

作　者: 时健
导　师: 杜秉海
学　校: 山东农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 遗传多样性系统发育拮抗菌番茄灰霉病生物防治
分类号: S436.412
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

从山东省寿光市和济宁市不同地区的番茄蔬菜大棚中采集11个番茄根际土壤样品，通过培养总共获得2892个细菌分离物。通过平板对峙法，以番茄灰霉病病原菌（Botrytiscinerea）为靶标菌，获得了168株番茄根际灰霉病拮抗菌。其中有34株拮抗菌具有高效稳定的拮抗作用，生防潜力很大。采用16S-RFLP，BOXAIR-PCR，16S rDNA全序列测序分析研究了168株番茄灰霉病拮抗菌的遗传多样性和系统发育，初步确定了拮抗菌的分类地位。BOXAIR-PCR聚类分析表明168株拮抗菌在87%的相似性水平上被分为33个群。其中包括两个大群，15和19；16个小群和14个由单菌株形成的群，聚类的结果与地域性没有任何联系。BOXAIR-PCR基因指纹图谱和聚类分析结果表明了这些拮抗菌具有丰富的遗传多样性。16S-RFLP分析结果在91.5%的相似性水平上将168株番茄灰霉病拮抗菌分为28个群，群3，4，5，10，12，14，15，16，17，18，19，21，23，25，26和28每一个群都包含单一的菌株。群6和13为两个大群。依据16S-RFLP, BOXAIR-PCR的聚类结果，从每个群中选出代表菌株做16S rDNA测序，并且在NCBI上检索序列的相似度并找出模式菌株。构建系统发育树结果表明，66株代表菌株来自于14个不同属的26个不同的种。Bacillus，Pseudomonas，Alcaligenes为优势属，分别有126，10，10个菌株。Pseudomonas，Bacillus，Streptomyces这三个分别至少包含3，8，5个不同的种。168株番茄灰霉病拮抗菌中革兰氏阳性菌占79.2%，而革兰氏阴性菌只20.8%。在所有的番茄灰霉病拮抗菌中有20.8%的拮抗菌对番茄灰霉病病原菌有较强的抑制效果。首次发现蜂类芽孢杆菌（Paenibacillus apiarius）、雷氏普罗维登斯菌（Providenciarettgeri）、缓慢葡萄球菌（Staphylococcus lentus)、苜蓿中华根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）、节杆菌（Arthrobacter arilaiti）、分产碱杆菌（Alcaligenes faecalis）、拟香味类香味菌（Myroides odoratimimus）、类短小芽孢杆菌（Brevibacillus parabrevis）、不动杆菌（Acinetobacter sp）、Tetrathiobacter mimigardensis对番茄灰霉病病原菌具有抑制作用。

全文目录

中文摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-39
  1.1 番茄的主要病害  11-14
    1.1.1 番茄灰霉病  11-14
      1.1.1.1 病原菌特征  12
      1.1.1.2 发病规律  12-13
      1.1.1.3 致病机理  13
      1.1.1.4 病害症状  13-14
  1.2 作物病虫害的防治发展  14-21
    1.2.1 番茄灰霉病的预报及防治  15-21
      1.2.1.1 流行病害预报  15
      1.2.1.2 抗病新品种的选育  15-16
      1.2.1.3 化学防治  16-17
      1.2.1.4 农艺防治  17-18
      1.2.1.5 生物防治  18-21
  1.3 植物根际促生菌（PGPR）  21-27
    1.3.1 PGPR 的由来  21-22
    1.3.2 PGPR 的种类  22
    1.3.3 PGPR 在植物根际表面的定殖  22-23
    1.3.4 PGPR 的作用机制  23-25
      1.3.4.1 微生物产生活性物质以促进植物的生长  23
      1.3.4.2 微生物可改善植物根际周围的营养环境  23-24
      1.3.4.3 拮抗和竞争作用  24
      1.3.4.4 诱导抗性机制  24-25
    1.3.5 PGPR 的研究现状  25-26
    1.3.6 PGPR 的实际应用  26-27
      1.3.6.1 PGPR 在林业上的应用  26-27
      1.3.6.2 PGPR 在农业上的应用  27
  1.4 微生物多样性  27-36
    1.4.1 微生物的表型多样性  29-30
    1.4.2 微生物遗传多样性  30
    1.4.3 微生物遗传多样性的研究方法  30-36
      1.4.3.1 形态学水平  31
      1.4.3.2 细胞学水平  31
      1.4.3.3 生化水平  31
      1.4.3.4 分子水平  31-36
  1.5 本研究的立项依据、研究方法与技术路线  36-39
    1.5.1 立项依据  36-37
    1.5.2 研究内容  37-38
    1.5.3 实验技术路线  38-39
2 材料与方法  39-49
  2.1 材料  39-41
    2.1.1 根际土样  39
    2.1.2 病原菌  39
    2.1.3 培养基  39
    2.1.4 DNA 提取试剂  39
    2.1.5 琼脂糖凝胶电泳试剂  39-40
    2.1.6 PCR 试剂  40
    2.1.7 连接转化试剂  40
    2.1.8 抗生素储存液  40
    2.1.9 主要仪器  40-41
  2.2 方法  41-49
    2.2.1 番茄根际细菌的分离  41
    2.2.2 番茄根际灰霉病拮抗菌的筛选  41-42
    2.2.3 拮抗菌的遗传多样性及系统发育分析  42-49
      2.2.3.1 拮抗菌 DNA 的提取  42-43
      2.2.3.2 琼脂糖凝胶电泳检测  43
      2.2.3.3 BOXAIR-PCR  43-44
      2.2.3.4 16S RDNA 序列 PCR 扩增  44-45
      2.2.3.5 PCR 产物的纯化  45
      2.2.3.6 PCR 扩增产物的限制性内切酶酶切  45
      2.2.3.7 数据处理  45-46
      2.2.3.8 PCR 产物的连接  46
      2.2.3.9 E. coli DH5Α感受态细胞的制备（氯化钙法）  46
      2.2.3.10 转化  46-47
      2.2.3.11 阳性克隆的筛选  47
      2.2.3.12 系统树的构建  47-48
      2.2.3.13 代表性菌株 16S rDNA 序列测定  48
      2.2.3.14 核苷酸序列登录号  48-49
3 结果与分析  49-57
  3.1 番茄根际菌的分离  49
  3.2 番茄根际灰霉病拮抗菌的筛选  49
  3.3 番茄根际灰霉病抗菌的遗传多样性和系统发育研究  49-57
    3.3.1 BOXAIR-PCR 聚类分析  50-52
    3.3.2 16S rDNA PCR-RFLP 聚类分析  52-54
    3.3.3 番茄灰霉病拮抗菌的 16S rDNA 序列及系统发育  54-57
4 讨论  57-59
5 结论  59-60
参考文献  60-70
致谢  70-71
攻读硕士学位期间发表论文情况  71

番茄根际灰霉病拮抗菌的筛选和遗传多样性研究

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