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江苏省蔬菜根结线虫的分布调查、种类鉴定及定量检测技术研究

作　者: 宋志强
导　师: 李红梅
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 根结线虫分布调查种类鉴定 SCAR标记实时荧光PCR 卵 2龄幼虫定量检测
分类号: S436.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

根结线虫(Root-knot nematode, RKN)是一类世界性分布的威胁农业生产的植物根系专性内寄生线虫。近年来,随着我国保护地蔬菜面积的迅速发展,复种指数的增加,根结线虫病呈逐年加重趋势,严重影响了作物的产量与品质。土壤中根结线虫的群体密度与作物的受害程度关系密切,因此,准确、可靠和快速地鉴定和计数土壤中的根结线虫,对该病害的有效防治至关重要。本研究对江苏省9个地区蔬菜根结线虫的分布、发生种类以及群体密度进行了调查,分别建立了根结属线虫和南方根结线虫的实时荧光PCR 定量检测方法,并利用此方法对田间土壤中的根结线虫进行了定量检测。主要结果如下：2011年对江苏省9个地区25个乡镇蔬菜根结线虫的分布、发生种类以及群体密度进行了调查。结果表明,根结线虫平均发生率为73.6%,土壤中的线虫群体密度最高达到2920条/200mL土样,宿迁、淮安等地区根结线虫发生率较高,达100%,而盐城地区根结线虫发生率相对较低,为57.1%。SCAR标记分子鉴定揭示为害江苏省蔬菜的根结线虫种类有南方根结线虫(Meloidogyne incognita)、花生根结线虫(M.arenaria)、爪哇根结线虫(M. javanica)和北方根结线虫(M. hapla)4类,其中南方根结线虫为优势种群。田间根结线虫种群大多数为单一种群,18%的样品为南方根结线虫与花生根结线虫或南方根结线虫与爪哇根结线虫2个种组成的混合种群。为了快速检测和定量土壤中根结属线虫的群体密度,根据根结属线虫的18SrDNA保守序列,设计了一对根结线虫属特异性引物,通过直接提取土壤DNA,建立了土壤中根结属线虫的SYBR Green I real-time PCR检测方法。结果表明,该方法能够从土壤DNA中特异检测出根结属线虫,建立的标准曲线循环阈值与根结线虫数量的对数值之间具有良好的线性关系,相关系数为0.9836,扩增效率为80%,检测灵敏度为1条2龄幼虫,比普通PCR检测高10倍;对10个田间土壤样品进行检测显示,real-time PCR检测与显微镜计数检测根结线虫的数量呈显著的正相关性。为了准确测定土壤中南方根结线虫的群体密度,根据SCAR标记设计了南方根结线虫特异性引物和TaqMan探针,分别建立了卵和2龄幼虫的real-time PCR定量检测体系,并将该体系与显微镜计数法进行了比较。结果表明,引物及探针对南方根结线虫具有高度特异性,建立的标准曲线循环阈值与卵和2龄幼虫数量的对数值之间具有良好的线性关系,相关系数分别为0.9771和0.9853,扩增效率均为90%,检测灵敏度为0.1个卵及0.001条2龄幼虫；对10个田间土壤样本的检测显示,real-time PCR定量检测与显微镜计数法测定的南方根结线虫卵和2龄幼虫数量呈显著的正相关性,且两种方法对2龄幼虫的测定结果无显著差异。本研究建立的根结属线虫和南方根结线虫定量检测体系,能够快速、灵敏、特异性地测定土壤中根结属线虫和南方根结线的种群密度,可为根结线虫病害的预测预报及综合防控策略的制定提供技术支持。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
上篇文献综述  10-29
  第一章根结线虫的分布、危害及防治  11-18
    1 根结线虫的发生与分布  11-12
    2 根结线虫的危害  12
    3 根结线虫的生物学特性  12-14
      3.1 根结线虫的生活史  12-13
      3.2 根结线虫的发生规律  13-14
    4 根结线虫病的防治方法  14-18
      4.1 选育和利用抗病品种  14-15
      4.2 农业防治  15
      4.3 物理防治  15-16
      4.4 生物防治  16-17
      4.5 化学防治  17-18
  第二章根结线虫的种类鉴定和检测方法  18-29
    1 根结线虫的传统鉴定和检测方法  18-21
      1.1 形态学特征  18-19
      1.2 鉴别寄主实验  19
      1.3 细胞遗传学方法  19-20
      1.4 同工酶电泳技术  20-21
    2 根结线虫的分子生物学鉴定和检测方法  21-29
      2.1 限制性片段长度多态性分析  21-22
      2.2 rDNA-PCR或rDNA-PCR-RFLP分析  22-23
      2.3 mtDNA-PCR-RFLP分析  23
      2.4 随机扩增多态性DNA和序列特异性扩增区  23-24
      2.5 环介导等温扩增技术  24-25
      2.6 DNA条形码技术  25
      2.7 实时荧光定量PCR技术  25-29
下篇研究内容  29-63
  第一章江苏省蔬菜根结线虫的分布调查及种类鉴定  31-39
    摘要  31
    ABSTRACT  31-32
    1 材料与方法  32-34
    2 结果与分析  34-38
      2.1 江苏省主要蔬菜种植区根结线虫病的分布调查  34
      2.2 江苏省蔬菜根结线虫病发生严重度的调查  34-36
      2.3 江苏省蔬菜根结线虫的种类  36-38
    3 讨论  38-39
  第二章根结属线虫的实时荧光PCR检测和定量  39-51
    摘要  39
    ABSTRACT  39-40
    1 材料与方法  40-44
    2 结果与分析  44-48
      2.1 引物特异性检测  44-46
      2.2 灵敏度比较  46-47
      2.3 Real-time PCR标准曲线的建立  47
      2.4 田间土壤样品中根结线虫的检测和定量  47-48
    3 讨论  48-51
  第三章土壤中南方根结线虫的实时荧光PCR检测和定量  51-63
    摘要  51
    ABSTRACT  51-52
    1 材料与方法  52-55
    2 结果与分析  55-60
      2.1 南方根结线虫引物和TaqMan探针的特异性检测  55-56
      2.2 Real-time PCR与常规PCR灵敏度比较  56-58
      2.3 南方根结线虫2龄幼虫和卵real-time PCR标准曲线的建立  58-59
      2.4 田间土壤中南方根结线虫2龄幼虫和卵的检测和定量  59-60
    3 讨论  60-63
全文结论  63-65
参考文献  65-75
致谢  75

江苏省蔬菜根结线虫的分布调查、种类鉴定及定量检测技术研究

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