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核盘菌激发子SsXYN的克隆、纯化及性质研究

作　者: 蒋冰心
导　师: 高智谋
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 激发子活性氧迸发植物防卫核盘菌 SsXYN
分类号: S435.654
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引发的油菜菌核病是油菜上的重要病害，目前对油菜菌核病的防治主要采取以种植抗菌核病品种、加强栽培管理为基础，化学防治为辅助的综合治理措施，近年来能够促进农业可持续发展的生物防治越来越受到广泛关注。植物病原菌产生的激发子是一种能够引起植物防卫反应的化合物，它通过与细胞表面或者亚细胞表面的受体分子结合启动植物体内级联信号系统以及活化防卫基因的表达等防御机制在抗病性中发挥作用，而不是通过杀菌作用，具有化学农药所不具备的优势和特点，可作为一种新型微生物蛋白农药来解决农业生产病虫害问题。本文研究的SxXYN基因是通过油菜核盘菌基因芯片信息中筛选出的可能诱导植物产生非寄主抗性的木聚糖酶基因。以核盘菌菌株NGA4提取的总RNA为模版，利用RT-PCR技术扩增获得SsXYN基因的全长cDNA片段，将其克隆到pMD19-T载体上，菌落PCR、酶切鉴定和T-克隆测序结果表明成功克隆了核盘菌SsXYN基因。从pMD19-T:SsXYN载体上，用BamH I和Sal I双酶切切下目的基因片段，将该基因片段连接到原核表达载体pET32a中。菌落PCR和酶切鉴定结果显示成功构建了表达载体pET32a:SsXYN。利用热击法将该重组表达载体导入大肠杆菌BL21，获得携带SsXYN基因的大肠杆菌菌株。将获得的重组质粒导入至易于表达的大肠杆菌BL21细胞中。筛选阳性单菌落并扩大培养，37℃用IPTG进行诱导。将诱导后的菌株用超声波破碎，利用His-tag融合蛋白的亲和纯化方法对产物进行纯化。SDS-PAGE电泳结果显示获得大小约78kDa的蛋白。将纯化后的蛋白注射至烟草中发现其能够体现与细菌激发子harpin类似的过敏反应。相关研究表明活性氧迸发是植物防卫反应的早期事件之一，该过程可产生以H2O2为主的活性氧。我们利用DAB染色法观测激发子SsXYN是否能够诱导活性氧迸发。结果显示，该激发子SsXYN在15min~3h能够诱导产生大量的红褐色聚合物沉淀，说明其在该时间段产生大量的H2O2，6h后红褐色聚合物沉淀大量减少直至没有，说明其诱导H2O2迸发的能力在后段时间内随时间的增加而减弱，该现象符合相关研究表明的激发子诱导活性氧迸发具有双时相特征。由于激发子能够诱导植物产生防卫反应，这些防卫反应的发生一般与相关防卫基因的表达有关。因此本实验将激发子SsXYN在0h、30min以及6h不同时间段注射于本式烟中，检测相关防卫基因的表达。qRT-PCR结果发现激发子SsXYN诱导HSR203J、NbPR1a、NbPR2b、NbLOX、EDS1、NbWIPK、NbWRKY2、NbMEK2、NbMAPKKKa进行上调表达；NbrbohA、NbrbohB、NbNR、NIA则受SsXYN激发子诱导进行下调表达；NOA1受激发子诱导表达但是改变并不明显。本研究相关实验的进行为揭示激发子诱发非寄主抗性分子机理和应用激发子防治油菜菌核病奠定基础，对于开发以病原菌激发子为主要成分的新型生物农药，设计高效、低毒的植物病害控制策略也具有重要的实践指导意义。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-8
目录  8-10
术语与缩略语表  10-11
1 文献综述  11-17
  1.1 油菜菌核病的发生及危害  11
  1.2 油菜菌核病的防治  11-13
  1.3 植物-病原菌互作研究进展  13-14
    1.3.1 基因对基因假说  13
    1.3.2 诱饵假说  13
    1.3.3 Zigzag 理论  13-14
  1.4 激发子的种类及其信号转导  14-17
    1.4.1 激发子种类  14
    1.4.2 激发子引起的信号转导  14-17
2 引言  17-19
3 材料与方法  19-31
  3.1 实验材料  19
    3.1.1 菌种和载体  19
    3.1.2 酶和化学试剂  19
    3.1.3 常用缓冲溶液和培养基  19
    3.1.4 抗生素及生长素  19
    3.1.5 仪器设备  19
  3.2 实验方法  19-31
    3.2.1 核盘菌 NGA4菌株的培养  19-20
    3.2.2 NGA4菌株 mRNA 的提取  20
    3.2.3 NGA4菌丝 cDNA 的合成  20-21
    3.2.4 常规分子克隆实验技术  21-23
    3.2.5 油菜菌核病菌 SsXYN 基因的克隆  23-24
    3.2.6 原核表达载体的构建  24
    3.2.7 原核蛋白诱导表达  24
    3.2.8 蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）  24-26
    3.2.9 His-tag 融合蛋白的亲和纯化  26
    3.2.10 DAB 染色  26-27
    3.2.11 烟草总 RNA 提取  27-28
    3.2.12 烟草 cDNA 的合成  28
    3.2.13 实时定量 PCR( qRT-PCR )检测基因的转录  28-31
4 结果与分析  31-42
  4.1 筛选可能具有激发子活性的油菜菌核病菌基因  31-32
  4.2 SsXYN 基因 PCR 扩增  32
  4.3 SsXYN 基因的 TA 克隆与鉴定  32-34
  4.4 pET32a: SsXYN 重组质粒构建  34-35
  4.5 重组载体导入大肠杆菌 BL21 感受态细胞  35-36
  4.6 重组载体蛋白原核诱导  36
  4.7 原核蛋白激发子活性检测  36-37
  4.8 DAB 染色检测 H2O2  37-38
  4.9 实时荧光定量 qRT-PCR 分析激发子对基因的表达影响  38-42
5 讨论  42-46
  5.1 木聚糖酶 SsXYN 可作为激发子诱发植物抗病反应候选基因  42
  5.2 激发子 SsXYN 能够诱发烟草过敏反应  42
  5.3 激发子 SsXYN 能够诱导活性氧的产生  42-43
  5.4 激发子 SsXYN 能够调控不同基因的表达  43-46
6 结论  46-47
参考文献  47-57
附录 A 常用缓冲液及培养基配制方法  57-58
附录 B 常用的抗生素和诱导剂及使用浓度  58-59
附录 C 仪器  59-60
致谢  60-61
作者简介  61
在读期间发表的学术论文  61

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