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马铃薯干腐病与黑痣病菌拮抗木霉菌的筛选及木霉菌遗传多样性分析

作　者: 崔岩
导　师: 柴兆祥
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 马铃薯干腐病黑痣病木霉菌新记录拮抗作用扩增片段长度多态性
分类号: S435.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本研究从甘肃马铃薯连作田采集耕作层土壤、分离木霉（TrichodermaPers.）菌株的基础上，开展了木霉菌对马铃薯干腐病和黑痣病拮抗菌株的筛选、木霉菌株1-X-2形态学与分子生物学鉴定及木霉菌AFLP遗传多样性分析的研究，取得了以下主要研究成果：1.五点取样法从甘肃省条山农场4个不同连作年限、8个不同马铃薯品种处理的马铃薯田0-20cm耕作层土壤中采集96份土样，采用系列稀释平板法分离木霉菌株，共分离到227株木霉菌菌株，统计分析表明：随着连作年限的延长，马铃薯耕作层土壤中的木霉菌数量呈下降趋势；不同品种马铃薯连作田土壤耕作层土壤中的木霉菌数量也不同，从栽培定薯1号品种的土壤中分离到的最多。2.以马铃薯干腐病优势病原菌接骨木镰刀菌（F.sambucinum）FSA、茄病镰刀菌（F.solani）FSO以及黑痣病病原立枯丝核菌（R.solani）RS1、RS2为靶标病原菌，对峙培养法筛选拮抗木霉菌株，结果筛选到4株对靶标病原菌均有明显拮抗效果的木霉菌株，抑制率均在70%以上。3.用致病性测定的方法开展了4株拮抗木霉菌株对马铃薯块茎的安全性测定，发现木霉菌株1-X-2对马铃薯不致病，不能导致马铃薯块茎腐烂，生防潜力最大。以形态学特征为依据，结合ITS序列分析，将菌株1-X-2鉴定为俄罗斯木霉（T.rossicum），为国内木霉新记录种，俄罗斯木霉的生防研究在国内亦为首次报道。4.分别选取对接骨木镰刀菌（F.sambucinum）FSA、茄病镰刀菌（F.solani）FSO、立枯丝核菌（R.solani）RS1、RS2四株靶标病原菌抑制率最高的10株与最低的10株，共40株木霉菌株，采用扩增片段长度多态性（AFLP）技术进行了遗传多样性的研究。试验中采用改良的SDS法提取基因组DNA、EcoRⅠ和MseⅠ同步双酶切，通过16个引物对组合进行了扩增，其中2对引物组合（E-T/M-G、E-A/M-C）能扩增出清晰、稳定且多态性高的条带，而E-T/M-G作用下的AFLP图谱中的多态性条带百分率最高，为91.84%。5.对每一种靶标病原菌拮抗效果明显的10株木霉菌株与拮抗效果相对较弱的10株木霉菌株基于引物对E-T/M-G进行聚类分析，发现这些菌株聚在AFLP条带聚类图的不同分支上，在DNA水平存在着丰富的遗传多样性；而且拮抗效果较好的木霉菌株大体聚为一类，拮抗效果相对较弱的木霉菌株大体聚为一类，初步反映出木霉菌株的聚类类群与其对靶标病原菌的拮抗效果有一定的相关性。

全文目录

摘要  2-4
summary  4-9
第一章文献综述  9-24
  1 马铃薯干腐病概况  9-12
    1.1 发生现状  9
    1.2 为害特点  9-10
    1.3 病原及种类  10-11
    1.4 发病规律  11-12
  2 马铃薯黑痣病概况  12-14
    2.1 发生现状  12
    2.2 为害特点  12
    2.3 病原  12-13
    2.4 发生规律  13-14
  3 木霉菌概况、生防机制及在植物病害防治中的应用  14-20
    3.1 木霉菌概况  14
    3.2 木霉菌的生防机制  14-19
      3.2.1 重寄生作用  14-16
      3.2.2 抗生作用  16
      3.2.3 竞争作用  16-17
      3.2.4 产酶机制  17-18
      3.2.5 诱导植物抗性  18
      3.2.6 协同拮抗作用  18-19
      3.2.7 其他生防机制  19
    3.3 木霉菌在防治马铃薯干腐病、黑痣病中的应用  19-20
  4 遗传多样性及应用  20-21
  5 AFLP分子标记技术  21-23
    5.1 AFLP分子标记技术及原理  21-22
    5.2 AFLP分子技术的应用  22
    5.3 AFLP技术在木霉菌遗传多样性研究中的应用  22-23
  6 试验研究的目的及意义  23-24
第二章拮抗木霉菌的分离筛选及鉴定  24-35
  1 材料与方法  24-27
    1.1 土样采集  24-25
    1.2 木霉菌的分离  25
      1.2.1 供试培养基  25
      1.2.2 木霉菌的分离、纯化与保存  25
    1.3 拮抗木霉菌的筛选  25-26
      1.3.1 供试病原菌  25
      1.3.2 筛选方法  25-26
    1.4 拮抗木霉菌株对马铃薯块茎的安全性测定  26
      1.4.1 供试品种及来源  26
      1.4.2 接种及评价方法  26
    1.5 木霉菌传统形态学鉴定  26-27
    1.6 木霉菌分子鉴定  27
      1.6.1 DNA的提取  27
      1.6.2 ITS-PCR扩增和测序分析  27
      1.6.3 序列同源性比较和聚类分析  27
  2 结果与分析  27-33
    2.1 不同处理马铃薯田耕作层土壤中木霉菌的数量变化  27-29
      2.1.1 不同连作处理中木霉菌菌株的数量变化  27-28
      2.1.2 不同品种土壤中木霉菌菌株的数量变化  28-29
    2.2 拮抗木霉菌的筛选结果  29-30
    2.3 安全性检测结果  30-31
    2.4 对木霉菌株1-X-2的鉴定结果  31-33
      2.4.1 形态学鉴定  31-32
      2.4.2 分子技术鉴定  32-33
  3 结论与讨论  33-35
第三章木霉菌AFLP遗传多样性分析  35-50
  1 材料与方法  35-42
    1.1 试验材料  35-38
      1.1.1 供试菌株  35-38
      1.1.2 DNA提取试剂与仪器  38
    1.2 试验方法  38-42
      1.2.1 菌丝体的制备  38
      1.2.2 DNA提取、纯化与检测  38-39
        1.2.2.1 DNA提取  38-39
        1.2.2.2 DNA纯化与检测  39
      1.2.3 AFLP分析方法  39-42
        1.2.3.1 酶切反应体系  39
        1.2.3.2 接头的制备  39-40
        1.2.3.3 连接反应体系  40
        1.2.3.4 预扩增  40
        1.2.3.5 选择性扩增  40-41
        1.2.3.6 制备6.0%聚丙烯酰胺凝胶  41
        1.2.3.7 6.0%聚丙烯酰胺凝胶电泳  41
        1.2.3.8 银染  41-42
        1.2.3.9 扫胶  42
        1.2.3.10 数据分析  42
  2 结果与分析  42-48
    2.1 木霉基因组DNA的提取结果  42
    2.2 木霉基因组DNA的酶切结果  42-43
    2.3 预扩增结果  43
    2.4 选择性扩增结果  43-44
    2.5 基于AFLP分子技术的木霉菌遗传多样性研究  44-48
      2.5.1 基于引物对E-T/M-G分析对接骨木镰刀菌FSA有不同拮抗效果的20株木霉菌株的遗传多样性  44-45
      2.5.2 基于引物对E-T/M-G分析对茄病镰刀菌FSO不同拮抗作用的20株木霉菌株的遗传多样性  45-47
      2.5.3 基于引物对E-T/M-G分析对丝核菌（RS1、RS2）不同拮抗效果的30株木霉菌的遗传多样性  47-48
  3 讨论  48-50
第四章主要结论与创新点  50-52
  1 主要结论  50
  2 创新点  50-52
参考文献  52-63
致谢  63-64
作者简介  64-65
导师简介  65-66

马铃薯干腐病与黑痣病菌拮抗木霉菌的筛选及木霉菌遗传多样性分析

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