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非寄主抗病抑制子AvrRxo1的双功能结构域鉴定

作　者: 常清乐
导　师: 储昭辉
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻细菌性病害非寄主抗病分泌蛋白三型分泌系统
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

由革兰氏阴性黄单胞杆菌水稻致病变种Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Xoo)引起的水稻白叶枯病和X. oryzae pv. oryzicola (Xoc)引起的水稻细菌性条斑病（简称水稻条斑病）是目前水稻生产上最主要的两种细菌性病害。尽管水稻白叶枯菌和条斑病菌在基因组DNA水平上的同源性达到90%以上，但是两者的侵染方式有显著差异。水稻白叶枯菌是在植物维管束中繁殖增生，而条斑菌则是以植物叶肉细胞间隙繁殖并致病。目前在水稻体内已经鉴定了30多个白叶枯菌的主效抗病基因，但迄今为止尚未鉴定抗水稻条斑病菌的主效基因。Zhao等（2004）仅在非寄主玉米B73上克隆获得Rxo1基因，能与条斑病菌的特性保守基因avrRxo1相互识别并激发抗性反应，Rxo1在后期抗病水稻品种的培育中也得到了很好的利用。尽管如此，条斑病菌的抗性资源仍然十分有限。Makino等（2006）的研究证实水稻条斑病菌能抑制病原无毒蛋白AvrXa10与抗病蛋白Xa10的识别互作，说明在病原菌中可能存在某些效应因子来抑制寄主的抗性反应。本研究通过建立白叶枯菌PXO99a和本生烟的互作模式体系来筛选条斑病菌RS105的基因组文库，发现携带有avrRxo1基因片段的克隆能抑制PXO99a在烟草上的HR反应。继而从不同菌株中分离获得了五个avrRxo1等位基因，经序列比对分析，发现这五个等位基因在核苷酸水平上存在8-11个不等的碱基差异，进而造成氨基酸水平上的多态性。实验证明不同avrRxo1的等位基因产物均能抑制白叶枯菌PXO99a在烟草上产生的HR反应，也能被抗病蛋白Rxo1所识别。通过系列蛋白截短实验明确：效应子AvrRxo1羧基端的完整性对两种功能非常重要，即使去除1个氨基酸便影响其非寄主抗病的抑制能力，去除3个氨基酸就影响其被Rxo1的识别；氨基端的任意截短对两种功能都有影响；另外，编码预测的ATPase活性位点和核定位位点对拥有两种功能也是必需的。将携带羧基端和氨基端不同截短的功能肽段以及蛋白重要位点突变的AvrRxo1转化菌株PXO99a接种携带不同抗白叶枯病基因的水稻材料，出乎意料地发现完整AvrRxo1并不能抑制水稻对白叶枯菌的抗性，侵染病斑长度反而缩短；与野生型菌株相比，含有完整AvrRxo1的PXO99a转化菌株在抗感病水稻材料上细菌生长量均明显减少。巧合的是，所有水稻品种的接种结果显示，抑制PXO99a致病性的功能域与其识别Rxo1的关键功能域保持一致，暗示AvrRxo1可能会激发水稻的抗病反应，属于共进化上被打败的病原效应分子。另一直接的证据进一步通过avrRxo1的水稻转基因株系来证明：超量表达avrRxo1基因的阳性株系能够显著提高对水稻条斑病菌RS105和白叶枯病菌PXO99a的抗性水平。与野生对照植株相比，RS105接种转基因阳性株系的病斑长度要减短0.5-0.7cm不等；接种PXO99a的病斑长度缩短3cm左右。此外，荧光定量PCR检测显示avrRxo1转基因水稻中抗病相关基因PR1a和PR10的本底表达水平显著升高，说明AvrRxo1可激发水稻中非Rxo1介导的抗性反应。综上所述，我们鉴定了条斑病菌效应因子AvrRxo1的新的功能并发现多个结构域能影响相关的功能，发现AvrRxo1可以抑制白叶枯菌PXO99a在本生烟上产生HR反应，但不能抑制寄主水稻对该菌的抗性，相反AvrRxo1可能会激发水稻对病原菌的抗性，这一系列的发现有望在水稻抗病遗传改良上获得应用。

全文目录

中文摘要  9-11
Abstract  11-13
1 前言  13-36
  1.1 水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病研究现状  13-15
    1.1.1 发生和分布  13-14
    1.1.2 危害症状  14
    1.1.3 病原分化  14-15
    1.1.4 传播途径和发生条件  15
    1.1.5 防治方法  15
  1.2 植物对病原菌的免疫反应  15-28
    1.2.1 植物的先天免疫反应  16-25
      1.2.1.1 病原相关分子模式激发的植物基础抗性  17-20
        1.2.1.1.1 病原模式相关分子与受体的识别  17-19
        1.2.1.1.2 PTI 信号传导途径  19-20
      1.2.1.2 植物 R 基因介导的质量抗病性  20-23
        1.2.1.2.1 质量抗病性的概念  21
        1.2.1.2.2 基因对基因假说  21
        1.2.1.2.3 防卫假说  21-22
        1.2.1.2.4 NBS-LRR 蛋白及其介导的 ETI 信号途径  22-23
      1.2.1.3 微效基因介导的数量抗病性  23-24
      1.2.1.4 非寄主抗性  24-25
    1.2.2 植物的后天免疫反应  25
    1.2.3 水稻白叶枯病和细菌性条斑病的抗性研究进展  25-28
      1.2.3.1 水稻白叶枯病的抗性遗传基础研究  25-27
      1.2.3.2 水稻条斑病抗性遗传研究  27-28
  1.3 病原菌的致病机制研究  28-35
    1.3.1 病原细菌对植物天然免疫的干扰  28
    1.3.2 病原细菌对植物防卫反应的抑制作用  28-30
    1.3.3 寄主植物相关感病途径  30-31
    1.3.4 非寄主植物与潜在病原微生物的互作  31
    1.3.5 水稻白叶枯菌和条斑病菌的致病机制研究  31-35
      1.3.5.1 水稻白叶枯病菌效应蛋白致病机制的研究  31-32
      1.3.5.2 水稻条斑病菌的致病相关研究  32-34
      1.3.5.3 无毒基因 avrRxo1 的研究现状  34-35
  1.4 目的意义  35-36
2 材料和方法  36-44
  2.1 植物材料与来源  36
  2.2 菌株  36
  2.3 RS105 基因组文库筛选  36-37
    2.3.1 基因组文库克隆的转化  36-37
      2.3.1.1 PXO99a 感受态细胞的简易制备（需现用现制）  36
      2.3.1.2 文库质粒的提取（SDS 碱裂解法）  36-37
      2.3.1.3 文库质粒的电击转化  37
    2.3.2 PXO99a 转化菌株接种 NB  37
  2.4 目的基因的鉴定与克隆  37-44
    2.4.1 目的基因序列分析  37
    2.4.2 目的基因的克隆  37-41
      2.4.2.1 不同扩增用途的引物设计  37
      2.4.2.2 avrRxo1 基因不同目的片段的分离  37-38
        2.4.2.2.1 条斑病菌株基因组的提取  37
        2.4.2.2.2 avrRxo1 基因不同目的片段 PCR 扩增体系的建立  37-38
        2.4.2.2.3 目的产物的切胶回收  38
      2.4.2.3 不同水稻条斑病菌株 avrRxo1 基因克隆载体的构建及氨基酸序列分析  38
      2.4.2.4 不同水稻条斑病菌株 avrRxo1 基因表达载体的构建  38-39
      2.4.2.5 RS105-avrRxo1 基因不同截短序列及位点突变的表达载体构建  39-40
      2.4.2.6 RS105-avrRxo1 基因超量表达载体构建  40
      2.4.2.7 空载体和目的片段的酶切产物纯化（乙醇沉淀）  40-41
      2.4.2.8 连接产物热激转化（转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞）  41
      2.4.2.9 质粒提取及不同表达载体电击转化 PXO99a 和农杆菌 EHA105  41
    2.4.3 不同菌株接种不同植物材料  41-42
      2.4.3.1 PXO99a 转化菌株接种玉米 B73  41
      2.4.3.2 PXO99a 转化菌株接种不同抗性的水稻材料  41
      2.4.3.3 水稻条斑病菌 RS105 接种水稻植株  41-42
    2.4.4 水稻细菌生长曲线检测  42
    2.4.5 农杆菌介导的遗传转化  42
    2.4.6 转基因植株阳性检测  42-43
      2.4.6.1 植物基因组 DNA 提取  42
      2.4.6.2 PCR 阳性检测  42
      2.4.6.3 GUS 染色  42-43
    2.4.7 RNA 提取  43
    2.4.8 RT-PCR  43
    2.4.9 荧光定量 PCR  43-44
3 结果与分析  44-61
  3.1 携带 avrRxo1 完整基因的克隆能抑制 PXO99a 在非寄主 NB 上产生的 HR 反应  44-45
    3.1.1 文库克隆 G20 能够抑制 PXO99a 在 NB 上产生 HR  44
    3.1.2 功能基因片段序列分析  44-45
  3.2 不同 avrRxo1 等位基因的同源性分析及进化分析  45-47
    3.2.1 五条斑菌 avrRxo1 等位基因的 PCR 扩增  45
    3.2.2 五种 avrRxo1 等位基因的 TA 克隆酶切检测  45
    3.2.3 不同 avrRxo1 等位基因的氨基酸同源序列分析  45-46
    3.2.4 不同水稻条斑病菌株的进化关系  46-47
  3.3 不同 avrRxo1 等位基因编码蛋白不影响与抗病蛋白识别和抑制子的功能  47-49
    3.3.1 不同 avrRxo1 等位基因表达载体的构建  47-48
      3.3.1.1 重组表达载体 pHM1:: avrRxo1RS105的 PCR 阳性检测  47
      3.3.1.2 RS85、JSB2-24、HNB4-47 及 SD-1 四菌株 avrRxo1 基因表达载体 PCR 检测...  47-48
    3.3.2 不同 AvrRxo1 蛋白均能与非寄主抗病蛋白 Rxo1 相互识别  48-49
    3.3.3 不同 AvrRxo1 蛋白不影响其抑制 PXO99a 在 NB 上产生 HR 反应的功能  49
  3.4 AvrRxo1 蛋白关键功能结构域的探索  49-55
    3.4.1 RS105 来源的 avrRxo1 基因不同结构域的 PCR 验证  50-52
      3.4.1.1 avrRxo1 基因不同截短序列表达载体的 PCR 验证  50-51
      3.4.1.2 AvrRxo1 蛋白重要酶活位点的融合突变  51-52
    3.4.2 AvrRxo1 与 Rxo1 识别及抑制烟草 HR 反应的关键功能结构域的鉴定  52-53
    3.4.3 AvrRxo1 造成 PXO99a 侵染病斑缩短的结构域与其识别功能域保持一致  53-55
    3.4.4 转化菌株 PXO99a(AvrRxo1)在水稻上的生长量显著降低  55
  3.5 AvrRxo1 在转基因水稻中的功能鉴定  55-61
    3.5.1 avrRxo1 基因超量表达载体的酶切检测  55-56
    3.5.2 avrRxo1 转基因株系的获得  56
    3.5.3 avrRxo1 转基因 T0 代株系的阳性检测  56-57
      3.5.3.1 avrRxo1 转基因 T0 株系的 PCR 检测  56-57
      3.5.3.2 avrRxo1 转基因阳性 T0 株系的 GUS 溶液染色  57
    3.5.4 avrRxo1 转基因阳性水稻株系对病原细菌的抗性增强  57-59
      3.5.4.1 avrRxo1 转基因 T0 阳性株系对水稻条斑病菌 RS105 产生抗性  57-58
      3.5.4.2 avrRxo1 转基因 T0 阳性株系对水稻白叶病菌增强抵抗力  58-59
    3.5.5 avrRxo1 基因在 T0 阳性株系中能够稳定表达  59-60
    3.5.6 avrRxo1 转基因 T0 阳性株系中 PR 基因表达水平显著提高  60-61
4 讨论  61-64
  4.1 病原效应子 AvrRxo1 的发掘为阐释致病机制带来新希望  61-62
  4.2 AvrRxo1 蛋白关键功能结构域的分析  62
  4.3 AvrRxo1 在病原菌与寄主水稻互作中的机制  62-64
5 结论  64-65
  5.1 AvrRxo1 蛋白具有多重功能  64
  5.2 AvrRxo1 蛋白关键功能结构域的解析  64
  5.3 AvrRxo1 蛋白能激发水稻非 Rxo1 介导的抗病反应  64
  5.4 avrRxo1 的转基因阳性株系对水稻病原细菌产生显著的抗性  64-65
6 结语  65-66
参考文献  66-78
附录 I 实验部分补充数据  78-82
附录 II 常用培养基及溶液配制  82-90
附录 III 硕士期间获得的研究成果  90-91
致谢  91

非寄主抗病抑制子AvrRxo1的双功能结构域鉴定

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