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禾谷丝核菌转录组中糖类活性酶基因组成和表达分析研究

作　者: 任向荣
导　师: 于汉寿；陈怀谷
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 禾谷丝核菌糖类活性酶转录组表达谱遗传转化
分类号: S435.121.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis Van der Hoeven)引起的小麦纹枯病(sharp eyespot)是一种世界性小麦病害,几乎遍布世界各个小麦种植区。在我国小麦纹枯病已成为小麦主产区小麦高产、稳产的重要威胁。引起我国小麦纹枯病的禾谷丝核菌属于双核丝核菌的AG-D融合群。国内外学者对禾谷产生丝核菌的田间快速检测、病害的化学防治及生物防治进行了较多的研究,但对该病原菌的流行学和致病机理等方面的研究很少。糖类活性酶(carbohydrate-active enzymes, CAZymes)的组成及含量与真菌的生活方式有密切的关系。具有腐植营养方式的病原菌含有较丰富的CAZymes。这类酶特别是糖基水解酶(glycoside hydrolases, GH)、多糖裂解酶(polysaccharide lyases, PL)、糖酯酶(carbohydrate esterases, CE)能够降解植物细胞壁多糖,是一种重要的致病因子。通过分析生长在诱导培养基的禾谷丝核菌R0301的转录组发现,禾谷丝核菌和非致病性担子菌双色蜡蘑Laccaria bicolor和灰盖鬼伞菌Coprinopsis cinerea亲缘关系较近。转录组中存在大量的CAZymes,特别是参与植物细胞壁(纤维素和半纤维素等)降解的酶类。进一步对生长在普通PSA培养基,诱导培养基和侵染植物的禾谷丝核菌数字基因表达谱(digital gene expression profiling, DGE)进行了分析,发现参与植物细胞壁(纤维素、半纤维素和果胶等)降解的CAZymes基因在PSA、诱导培养基和侵染植物时表达存在很大的差异。与诱导培养基上相比,侵染植株时禾谷丝核菌纤维素降解相关基因的表达量较低,降解半纤维素酶类基因表达量较高,说明在侵染时病菌可能主要裂解小麦植株细胞壁的半纤维素多糖。在侵染小麦植株时,CE3(unigene8051), CE12(unigene16042)和PL1(unigene629)等基因上调表达明显,这些基因在禾谷丝核菌致病过程中可能起重要作用。利用实时荧光定量PCR技术验证部分基因的表达,发现它们的表达模式同表达谱基本一致,不同侵染阶段的表达水平存在一定差异。GH10家族蛋白降解谷类作物细胞壁半纤维素时,并不受谷类作物产生的TAXI-like蛋白抑制因子的影响,但GH11却受到该蛋白抑制因子的抑制。GH10家族蛋白可能是谷类作物病原菌重要的致病因子之一。为进一步探索GH10家族蛋白的具体功能,利用RACE方法并结合生物信息学手段,得到了两个GH10成员的全长cDNA序列,为后续研究GH10在禾谷丝核菌致病过程中的作用奠定了基础。为进一步研究降解植物细胞壁CAZymes在侵染和致病过程中的作用等,本文通过对菌丝酶解时间、获取幼嫩菌丝方法及酶种类等因素进行优化,建立了禾谷丝核菌高效、稳定的原生质体制备体系。形态学及致病性的比较发现原生质体再生菌株和原始菌株之间差异不显著。该体系的获得为禾谷丝核菌遗传转化、原生质体融合等体系的建立奠定了基础。并且尝试了PEG-原生质体转化和农杆菌介导的转化等方法,没有成功建立禾谷丝核菌的遗传转化体系。

全文目录

目录  4-7
摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
文献综述  11-35
  1 小麦纹枯病的研究进展  11-16
    1.1 小麦纹枯病的分布和危害  11
    1.2 病原菌  11-14
      1.2.1 病原菌种类  11-12
      1.2.2 病原菌的形态学及生物学特性  12-14
    1.3 病原菌生活史及引起的症状  14
    1.4 小麦纹枯病的发生规律以及影响因素  14-15
    1.5 小麦纹枯病的预防及防治措施  15-16
      1.5.1 化学防治  15
      1.5.2 农业防治  15
      1.5.3 生物防治  15-16
      1.5.4 选育抗病品种  16
  2 植物病原真菌致病相关基因的研究  16-20
    2.1 致病相关基因  16-17
    2.2 糖类活性酶(carbohydrate-active enzymes,CAZymes)的研究  17-20
      2.2.1 糖类活性酶组成及其功能  18-20
  3 转录组学研究进展  20-25
    3.1 转录组的测序技术  20-21
      3.1.1 第一代测序技术  20
      3.1.2 第二代测序技术  20-21
      3.1.3 第三代测序技术  21
    3.2 转录组研究方法及丝核菌转录组的研究现状  21-25
      3.2.1 转录组研究方法  21-24
      3.2.2 丝核菌转录组的研究  24-25
  4 本研究的目的和意义  25-26
  参考文献  26-35
第一章禾谷丝核菌转录组中糖类活性酶的组成分析  35-49
  摘要  35
  前言  35-36
  1 材料和方法  36-40
    1.1 试验材料  36-37
      1.1.1 试验供试菌株和小麦品种  36
      1.1.2 主要试剂  36-37
    1.2 试验方法  37-40
      1.2.1 提取植物细胞壁CW  37
      1.2.2 供试菌株培养  37
      1.2.3 总RNA提取  37-39
      1.2.4 转录组测序及组装及分析  39
      1.2.5 禾谷丝核菌转录组中CAZymes的组成  39
      1.2.6 禾谷丝核菌的CAZymes和其他菌的比较  39-40
  2 结果与分析  40-45
    2.1 禾谷丝核菌R0301菌株总RNA的质量和浓度  40
    2.2 转录组测序概况  40
    2.3 禾谷丝核菌转录组中糖类活性酶基因的组成  40-45
  3 讨论  45-46
  参考文献  46-49
第二章禾谷丝核菌糖类活性酶基因的表达分析及RT-qPCR验证  49-63
  摘要  49
  前言  49-50
  1 材料和方法  50-53
    1.1 试验材料  50
      1.1.1 供试菌株及小麦品种  50
      1.1.2 主要试剂  50
    1.2 试验方法  50-53
      1.2.1 荧光定量PCR引物设计  50-51
      1.2.2 侵染试验  51
      1.2.3 提取总RNA  51
      1.2.4 建立数字化基因表达谱  51-52
      1.2.5 反转录  52
      1.2.6 荧光定量PCR  52-53
  2 结果与分析  53-60
    2.1 荧光定量PCR引物  53
    2.2 侵染试验  53-54
    2.3 提取样品的总RNA  54-56
    2.4 禾谷丝核菌表达谱中差异表达基因分析  56
    2.5 表达谱中参与降解植物细胞壁的酶类基因的表达  56-58
    2.6 RT-qPCR验证部分酶类基因在不同侵染阶段的表达  58-60
  3 讨论  60-61
  参考文献  61-63
第三章禾谷丝核菌木聚糖酶基因的克隆  63-75
  摘要  63
  前言  63-64
  1 材料和方法  64-68
    1.1 试验材料  64-65
      1.1.1 试验供试菌株  64
      1.1.2 主要试剂  64-65
    1.2 试验方法  65-68
      1.2.1 RACE克隆基因全长  65-68
      1.2.2 分析基因序列  68
  2 结果与分析  68-72
    2.1 RACE克隆基因并结合生物信息学分析  68-72
  3 讨论  72-73
  参考文献  73-75
第四章禾谷丝核菌原生质体的制备及遗传转化  75-89
  摘要  75
  前言  75-76
  1 材料和方法  76-79
    1.1 材料  76-77
      1.1.1 供试菌株  76
      1.1.2 主要试剂  76-77
    1.2 试验方法  77-79
      1.2.1 原生质体制备  77
      1.2.2 原生质体的计数、核染色及再生  77-78
      1.2.3 原生质体再生菌株致病力测定  78
      1.2.4 菌株DNA的提取及AFLP差异分析  78
      1.2.5 建立遗传转化体系  78-79
  2 结果与分析  79-84
    2.1 菌丝获得方法及细胞壁消解酶和渗透压稳定剂处理对原生质体制备的影响  79-81
    2.2 原生质体核染色、萌发及再生  81-83
    2.3 再生菌株的生长速率及致病力分析  83
    2.4 对原生质体再生菌株的AFLP差异分析  83-84
    2.5 遗传转化体系  84
      2.5.1 选择转化子的潮霉素B浓度测定  84
      2.5.2 遗传转化  84
  3 讨论  84-87
  参考文献  87-89
全文总结  89-91
  一、本文获得的主要结果  89
  二、本文的主要创新点  89
  三、尚待解决的问题  89-91
攻读硕士期间发表的学术论文  91-93
致谢  93

禾谷丝核菌转录组中糖类活性酶基因组成和表达分析研究

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