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RBSDV和SRBSDV安徽分离物全基因组特征及SRBSDV mp基因的功能分析

作　者: 李祥宇
导　师: 江彤
学　校: 安徽农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 水稻黑条矮缩病毒 南方水稻黑条矮缩病毒 分子鉴定 全基因组特征 运动蛋白
分类号: S435.111.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


近年来，水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV）和南方水稻黑条矮缩病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV）引起的水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病在安徽省各稻区以及玉米种植区危害日益严重，生产上仅凭症状难以区分两种病毒，本研究利用RT-PCR方法能够实现一次性检测和鉴定RBSDV和SRBSDV2种病毒。为了深入了解安徽省RBSDV和SRBSDV起源及演化关系，本研究克隆了2个RBSDV和1个SRBSDV安徽分离物S1-S10基因组各个组分并测定序列全长，以期明确RBSDV和SRBSDV安徽省分离物的分子变异以及遗传进化特征。另外，植物病毒从侵染位点径向运动到临近细胞是成功建立系统侵染的关键，而病毒编码的运动蛋白（MPs）即参与病毒的转运。目前，协助SRBSDV在植物细胞间转移的运动蛋白尚不明确，本研究拟构建SRBSDV3个基因的植物表达载体，初步鉴定SRBSDV可能编码的运动蛋白。对明确SRBSDV系统侵染的分子机制以及分析其他基因的功能奠定了基础。1安徽省RBSDV和SRBSDV的分子鉴定根据RBSDV和SRBSDV S9保守序列设计3个特异性引物，不仅可以从单独感染RBSDV或SRBSDV的水稻样本中分别扩增出1条大小不同的特异性条带，而且还可以从感染RBSDV和SRBSDV的混合水稻样本中一次性扩增出2条大小不同的特异性条带。从安徽省4个县市水稻田采集矮缩水稻样本，RT-PCR检测发现，庐江和郎溪水稻样本受到RBSDV侵染，怀宁和宣州水稻样本受到SRBSDV侵染。将特异性条带克隆和测序，序列分析表明，庐江、郎溪2个样本的核苷酸序列与RBSDV山东和浙江分离物S9部分片段序列相似性高达99.3%~99.8%，且与RBSDV的亲缘关系最近，说明庐江和郎溪样本感染的病毒是RBSDV的2个分离物；怀宁、宣州2个样本的核苷酸序列与SRBSDV山东和海南S9部分片段序列相似性高达99.5%，且与SRBSDV亲缘关系最近，说明怀宁和宣州样本感染的病毒是SRBSDV的2个分离物。2RBSDV和SRBSDV安徽分离物S1-S10全序列的测定及其序列分析采集安徽省萧县玉米粗缩病样、庐江县和怀宁县水稻黑条矮缩病样，提取总RNA，设计特异性引物扩增了2个RBSDV安徽分离物以及1个SRBSDV安徽分离物（RBSDV-MX8，RBSDV-LJ，SRBSDV-HN2）全基因组序列，3个分离物S1-S10全基因组序列全长分别为29141nts、29142nts和29121nts。将RBSDV和SRBSDV安徽分离物S1-S10分别与斐济病毒属其他成员以及同种病毒分离物间进行序列比对，结果发现，RBSDV和SRBSDV与斐济病毒属其他成员S1-S10相似性分别为26.3%~84.8%、20.7%~74.8%、20.9%~99.5%、21.1%~99.5%、20.0%~99.5%、20.5%~99.6%、21.6%~100.0%、21.3%~99.8%、21.9%~99.7%和21.3%~99.8%，其中RBSDV分离物之间S1-S10相似性分别为53.1%~68.4%、65.3%~74.8%、72.2%~90.5%、94.6%~98.6%、93.3%~98.5%、91.6%~98.6%、93.7%~99.4%、94.0%~99.1%、88.6%~99.7%和93.2%~99.0%，SRBSDV分离物之间S1-S10相似性分别为83.3%~85.3%、67.8%~70.1%、80.5%~99.4%、97.5%~99.5%、98.3%~99.5%、97.4%~99.6%、99.1%~100.0%、98.9%~99.8%、98.6%~99.7%、98.7%和99.8%，RBSDV分离物与SRBDV分离物之间S1-S10的相似性分别为56.8%~75.3%、58.3%~68.9%、21.2%~23.6%、20.5%~22.1%、63.2%~65.8%、59.6%~62.8%、66.3%~67.2%、65.0%~67.8%、67.7%~70.2%和73.5%~75.9%。进一步构建S1-S10不同组分的系统关系树，RBSDV与SRBSDV分别聚成各自独立的分支，说明RBSDV和SRBSDV的亲缘关系较远。3SRBSDV mp基因的初步鉴定克隆SRBSDV S9-2、S7-2和S5-2基因，构建重组表达载体pBin-S9-2、pBin-S7-2和pBin-S5-2，分别与运动缺陷型PVX载体（pPVX-GUS-BSP）共轰击本氏烟叶片。 pBin-S7-2与pPVX-GUS-BSP共轰击本氏烟（Nicotianabenthamiana）叶片，组织化学染色后直接观察，可见蓝色斑点，在显微镜下观察，发现GUS基因编码的蛋白已扩展到多个细胞。而pBin-S9-2、pBin-S5-2分别与PVX-GUS-BSP共轰击本氏烟则观察不到蓝色斑点。说明pBin-S7-2在35S启动子驱动下能够互补PVX-GUS-BSP的运动功能，因此可以初步认为SRBSDVS7-2可能编码运动蛋白。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-13
文献综述  13-25
  1 呼肠孤病毒的分类与结构特征  13-15
    1.1 呼肠孤病毒的分类  13
    1.2 呼肠孤病毒的结构特征  13-15
  2 斐济病毒属  15-17
    2.1 斐济病毒属的分类  15-16
    2.2 斐济病毒属侵染寄主及症状  16
    2.3 斐济病毒属侵染寄主及传播途径  16
    2.4 斐济病毒属形态学特征  16
    2.5 斐济病毒属基因组结构  16-17
  3 水稻黑条矮缩病研究进展  17-19
    3.1 水稻黑条矮缩病的发病情况  17
    3.2 水稻黑条矮缩病的病原及症状  17
    3.3 水稻黑条矮缩病的寄主及传毒介体  17-18
    3.4 水稻黑条矮缩病毒的基因组结构与功能  18-19
  4 水稻南方黑条矮缩病研究进展  19-22
    4.1 水稻南方黑条矮缩病的发病情况  19
    4.2 水稻南方黑条矮缩病的病原  19-20
    4.3 水稻南方黑条矮缩病的症状  20
    4.4 南方水稻黑条矮缩病毒的寄主及传毒介体  20-21
    4.5 南方水稻黑条矮缩病毒的基因组结构与功能  21-22
  5 植物病毒编码的运动蛋白  22-25
    5.1 运动蛋白的作用方式  22-23
    5.2 运动蛋白介导病毒细胞到细胞间运动的分子机制  23
    5.3 运动蛋白在病毒长距离运输中的作用  23-24
    5.4 运动蛋白介导的植物抗病性  24-25
引言  25-26
材料与方法  26-44
  1 供试材料  26
    1.1 病样来源  26
    1.2 植物材料  26
    1.3 菌种和载体  26
    1.4 酶和化学试剂  26
    1.5 常用缓冲溶液和培养基  26
    1.6 抗生素  26
    1.7 仪器设备  26
  2 试验方法  26-44
    2.1 叶片总 RNA 的提取  26-27
      2.1.1 提 RNA 的准备工作  26-27
      2.1.2 Trizol 抽提液提取总 RNA 方法  27
    2.2 cDNA 的合成  27-28
    2.3 PCR 技术  28
    2.4 PCR 产物的克隆  28-32
      2.4.1 PCR 产物回收和纯化  28-29
      2.4.2 PCR 产物的连接  29
      2.4.3 感受态细胞的制备  29-30
        2.4.3.1 Ecoli DH5α感受态细胞的少量制备（CaCl2法）  29-30
        2.4.3.2 农杆菌感受态细胞的少量制备  30
      2.4.4 连接产物的转化  30-31
        2.4.4.1 连接产物转化大肠杆菌  30
        2.4.4.2 连接产物转化农杆菌（冻融法）  30-31
      2.4.5 阳性克隆的 PCR 鉴定  31
      2.4.6 质粒提取  31-32
    2.5 克隆基因的测序、分析和登录  32
    2.6 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S9 部分片段的克隆  32
      2.6.1 S9 部分片段的克隆引物设计  32
      2.6.2 S9 部分片段的 RT-PCR 扩增  32
    2.7 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S9 部分片段的序列分析  32-33
    2.8 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物全基因组的克隆  33-38
      2.8.1 全基因组的克隆引物设计  33-37
      2.8.2 全基因组的克隆 PCR 扩增  37-38
    2.9 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物全基因组的序列分析  38-40
    2.10 全基因组的序列拼接、确认及提交  40-41
    2.11 植物表达载体的构建  41-43
      2.11.1 构建植物表达载体所用引物设计  41
      2.11.2 SRBSDV S9-2、S7-2 和 S5-2 片段的克隆  41
      2.11.3 SRBSDV S9-2、S7-2 和 S5-2 植物表达载体的构建  41-42
      2.11.4 重组植物表达载体转入农杆菌  42
      2.11.5 农杆菌浸润接种  42-43
    2.12 基因枪轰击  43
    2.13 GUS 染色方法  43
    2.14 共聚焦显微镜观察  43-44
结果与分析  44-78
  1 安徽省 RBSDV 和 SRBSDV 的分子检测和序列分析  44-47
    1.1 安徽省 RBSDV 和 SRBSDV 的分子检测  44-45
      1.1.1 水稻样本的检测  44
      1.1.2 RBSDV 和 SRBSDV 单独侵染样本及混合样本的检测验证  44-45
      1.1.3 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S9 部分片段的克隆和测序  45
    1.2 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S9 部分片段序列比较及分子进化分析  45-47
  2 RBSDV 和 SRBSDV 全基因组的克隆与序列测定  47-48
    2.1 RBSDV 和 SRBSDV 安徽省分离物全基因组的克隆  47
    2.2 RBSDV 和 SRBSDV 安徽省分离物 S1-S10 全基因组序列的测定  47-48
  3 RBSDV 和 SRBSDV 全基因组的序列分析  48-71
    3.1 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S1 全基因组序列分析  48-50
    3.2 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S2 全基因组序列分析  50-52
    3.3 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S3 全基因组序列分析  52-54
    3.4 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S4 全基因组序列分析  54-56
    3.5 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S5 全基因组序列分析  56-58
    3.6 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S6 全基因组序列分析  58-60
    3.7 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S7 全基因组序列分析  60-63
    3.8 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S8 全基因组序列分析  63-65
    3.9 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S9 全基因组序列分析  65-68
    3.10 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物 S10 全基因组序列分析  68-71
  4 SRBSDV mp 基因的初步鉴定  71-78
    4.1 利用 PVX 运动缺陷型载体鉴定运动蛋白  71-75
      4.1.1 SRBSDV S9-2、S7-2、S5-2 的克隆  71-73
      4.1.2 SRBSDV S9-2、S7-2、S5-2 植物表达载体的构建  73-74
      4.1.3 PVX 运动缺陷型载体鉴定运动蛋白  74-75
    4.2 SRBSDV S7-2、S5-2 在烟草表皮细胞中的定位  75-78
      4.2.1 重组表达载体的构建  75-77
        4.2.1.1 SRBSDV S9-2、S7-2、S5-2 的克隆  75-76
        4.2.1.2 重组表达载体的酶切  76-77
      4.2.3 SRBSDV S7-2，S5-2 在烟草表皮细胞中的定位  77-78
讨论  78-81
  1 RBSDV 和 SRBSDV 的 RT-PCR 检测  78
  2 RBSDV 和 SRBSDV 安徽分离物全基因组序列的测定与分析  78-79
  3 SRBSDV mp 基因的初步鉴定  79-81
结论  81-82
参考文献  82-87
附录 A：常用缓冲液及培养基配方法  87-90
附录 B：常用的抗生素和激素及使用浓度  90-91
附录 C：常用化学试剂、分子生物学试剂及仪器  91-93
附录 D：本文所用的重要缩写词及中文对照  93-94
致谢  94-95
作者简介  95
[附] 硕士在读期间发表论文  95

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 农作物病虫害及其防治 > 禾谷类作物病虫害 > 稻病虫害 > 病害 > 侵（传）染性病害
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