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生防菌FD6的鉴定及硝吡咯菌素调控基因克隆与功能分析

作　者: 常琳
导　师: 张清霞
学　校: 扬州大学
专　业: 植物病理学
关键词: 硝吡咯菌素假单胞菌作用机制灰葡萄孢
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

拮抗细菌FD6分离自福建闽侯青口青菜根围土壤,该菌株抑菌谱广,可抑制多种植物病原真菌生长,细菌悬浮液可显著抑制番茄灰霉病菌分生孢子萌发,抑制率达99%,离体叶片生物测定结果显示菌株FD6对番茄灰霉病防效达59.7%。经16S rDNA序列比对和相关生理生化性状分析,将FD6菌株鉴定为荧光假单胞菌P. fluorescens。经测定菌株FD6可产生硝吡咯菌素(PRN)、2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)、藤黄绿脓菌素(PLT)、嗜铁素、氢氰酸和蛋白酶等抗菌物质,不产生吩嗪-1-羧酸,其中,硝吡咯菌素可直接抑制番茄灰霉病菌分生孢子萌发和菌丝的生长。双因子调控系统(two-component regulatory system)广泛存在于细菌中,包括感受激酶(Sensor kinase) GacS和反应调控因子(Response regulator) GacA。为明确gacS对细菌FD6生防功能的影响,本论文构建了gacS基因的插入突变菌株FD6-MS及其互补菌株FD6-S。通过比较野生型FD6及其突变体生物学性状,发现突变菌株丧失产硝吡咯菌素、2,4-二乙酰基间苯三酚、藤黄绿脓菌素、HCN及蛋白酶的能力,嗜铁素、生物膜的产生能力也显著下降,但对菌株生长速率影响较小,结果表明,gacS基因对于这些次生物质的产生具有重要的调控作用。此外对番茄灰霉病和桃褐腐病的生物测定实验结果表明,gacS突变菌基本丧失了对这两种病原真菌的抑制作用,病斑直径与对照组接近,互补菌恢复了防病能力,说明gacS基因是生防细菌FD6中一个重要调控元件。为了筛选影响PRN转录与表达的特异性调控因子,本研究以p-半乳糖苷酶活性为筛选指标,利用Tn5转座子可以在基因组中随机插入突变的方法,建立了FD6突变体库,并筛选到3株β-半乳糖苷酶活性显著变化的突变体,依次是prnA基因、hemK基因和ATP-binding protein内部。在P. fluorescens FD6中,prnA基因为PRN结构基因,与PRN的合成密切相关。缺失互补实验证实prnA基因对于菌株的生长速率和对病原菌的拮抗能力没有影响,β-半乳糖苷酶活性变化显示,prnA在转录水平上负调控PRN产生,可能该基因对PRN有反馈调节作用。

全文目录

缩略语  4-5
中文摘要  5-6
英文摘要  6-8
前言  8-21
  1 荧光假单胞菌的生防作用  8-12
  2 硝吡咯菌素  12-19
  3 生防细菌的遗传改良  19
  4 研究目的和意义  19-20
  5 研究内容与技术路线  20-21
材料与方法  21-43
  1 供试菌株和质粒  21-23
  2 培养基  23-24
  3 主要试剂  24
  4 常用溶液  24-26
  5 DNA基本操作方法  26-30
  6 生防细菌FD6的鉴定及其对番茄灰霉病菌的作用机制  30-32
    6.1 拮抗细菌FD6对植物病原真菌的抑制作用  30
    6.2 菌株FD6的鉴定  30-31
    6.3 生防作用机制分析  31-32
  7 抗生素硝吡咯菌素调控基因的克隆与功能分析  32-34
    7.1 gacS基因插入突变及基因互补  32-33
    7.2 生长曲线测定  33
    7.3 对植物病原真菌的平板拮抗作用  33
    7.4 生防相关性状检测  33-34
    7.5 FD6及其突变体防治桃褐腐病试验  34
    7.6 FD6及其突变体防治番茄灰霉病试验  34
  8 FD6抗生素硝吡咯菌素合成调控基因的筛选、克隆及功能分析  34-43
    8.1 部分硝吡咯菌素合成基因簇及其上游序列的克隆  34-38
    8.2 pRG970Gm载体的特征  38-39
    8.3 FD6prnA-lacZ融合子的构建  39
    8.4 Tn5转座诱变及突变子的筛选  39-40
    8.5 突变子侧翼序列的克隆  40
    8.6 prnA基因的缺失突变和基因互补  40-41
    8.7 β-半乳糖苷酶活性的测定方法  41-42
    8.8 生物学测定方法  42-43
结果与分析  43-59
  1 生防细菌FD6的鉴定及其对番茄灰霉病菌的作用机制  43-46
    1.1 菌株FD6的抑菌谱  43
    1.2 拮抗细菌FD6对番茄灰霉病菌的抑制作用  43
    1.3 菌株FD6的鉴定  43-44
    1.4 抗生素的检测  44-46
  2 P.fluorescens FD6中生防相关调控基因gacS部分基因的克隆和功能分析  46-53
    2.1 gacS部分基因克隆  46-47
    2.2 gacS基因插入及基因互补  47-48
    2.3 gacS突变体对病原真菌的拮抗作用  48-49
    2.4 gacS突变体对菌株生长的影响  49
    2.5 生防相关性状的检测  49-51
    2.6 生物膜的定量检测  51-52
    2.7 生防效果测定  52-53
  3 菌株FD6抗生素PRN的调控基因的克隆与功能验证  53-59
    3.1 硝吡咯菌素prnA基因及其上游序列的克隆及序列分析  53-55
    3.2 菌株FD6 PRN调控基因的克隆  55-57
    3.3 prnA基因在转录水平对PRN的影响  57-58
    3.4 FD6野生菌株及其prnA突变菌株对病原真菌拮抗作用  58-59
讨论  59-62
  1 生防细菌FD6的鉴定及其对番茄灰霉病菌的作用机制  59
  2 gacS部分基因的克隆和功能分析  59-60
  3 prnA基因的克隆与功能验证  60-62
参考文献  62-68
附录一  68-69
附录二  69-71
附录三  71-77
附录四  77-79
致谢  79-80
攻读学位期间发表的学术论文  80-81

生防菌FD6的鉴定及硝吡咯菌素调控基因克隆与功能分析

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