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几株昆虫病原菌微菌核的诱导培养和条件优化

作　者: 杨欣
导　师: 李增智
学　校: 安徽农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 微菌核液体发酵白僵菌金龟子绿僵菌响应面
分类号: S476.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

蛴螬、蟋蟀、根蝽、白蚁等地下害虫一生中大部分在土壤中生活，为害植物地下部或地面附近根茎部。现在对它们的防治一般采用化学农药，在用昆虫病原真菌防治地下害虫的研究中，布氏白僵菌防治蛴螬的报道较多，但由于地下害虫常在土壤深层栖息，活动量小，一般在春秋季才向土表移动，且在旱作地区普遍发生，普通的孢子制剂可能因储藏期或施放后无法适应气候环境的变化，而影响防治效果。因此需要一种耐干旱、易储藏的繁殖体来防治地下害虫。本研究通过改变营养条件在液体培养中人工诱导产生微菌核（Microsclerotia，以下简称MS），结果表明氮源种类的选择决定是否产生MS，且不同菌种产MS的最佳氮源不尽相同，不添加吐温-80对MS产生也无影响；通过一系列的单因素实验，从球孢白僵菌、布氏白僵菌、金龟子绿僵菌共9个菌株中各筛选1株高产MS的菌株Bb2729、Bbr17和Ma55。其在碳含量32g／L时MS产量分别为3.87×103MS／mL、6.80×103MS／mL和4.07×103MS／mL。单因素实验为基础，进行碳氮源用量比例复筛，发现MS产量和生物量均受碳源浓度和碳氮比共同作用，并通过对接种量等非营养条件的单因素实验，确定进一步优化方案。以碳浓度、碳氮比、摇床转速、孢悬液接种量和培养液装液量为五个因子，MS产量和生物量为响应值，进行两水平部分因子实验，筛选显著影响因子，结果Bb2729、Bbr17和Ma55三株菌的显著因子均为碳浓度、碳氮比和接种量；最陡爬坡实验确定响应面的中心点，Bb2729：碳浓度27g／L、碳氮比8:1、接种量0.9％，Bbr17：碳浓度30g／L、碳氮比7:1、接种量1.0％，Ma55：碳浓度30g／L、碳氮比35:1、接种量0.85％；Box-Benhnken中心复合实验确定MS产量的理论最大值，其中布氏白僵菌Bbr17产量最高为8.24×103MS／mL （碳浓度27.07g／L、接种量0.84％、碳氮比7.29:1），其次是球孢白僵菌Bb2729：5.57×103MS／mL （碳浓度27.07g／L、接种量0.84％、碳氮比7.29:1），金龟子绿僵菌Ma55：4.63×103MS／mL （碳浓度30.29g／L、接种量0.84％、碳氮比34.66:1）；理论值条件下分别对各株菌进行三批次验证试验，结果与理论值相比均在1％误差以内，说明了响应面实验结果的可信度。MS的耐旱实验，将三株真菌碳氮比复筛时各个实验组得到的发酵产物，加硅藻土（diatomite，以下简称DE），抽滤冻干粉碎制成MS-DE粉末，在4℃冷藏条件下，4个月时复苏率仍维持在90％以上，低碳、高碳氮比发酵得到的MS复苏率高达到100％。MS-DE短期恒温储存试验表明，温度是影响MS储藏期的重要因素，在4℃冷藏条件下，MS-DE复苏率下降速度缓慢，60天后复苏率仍维持在98％以上。在31℃条件下，MS-DE复苏下降趋势显著增强，但均在也87％以上，相比之下布氏白僵菌MS更耐储藏，31℃储藏60天复苏率仍能达到91.93±1.58％。剂型化对MS复苏率有一定影响，但的确有一定保护作用。室温长期储存实验中，MS-DE第4个月时复苏率开始急速下降，到第10个月最低下降至40.22％；剂型化MS复苏率在第6个月才开始明显下降，10个月后最低降至55.19％，可见MS本身具备了一定抗逆性，而在制剂保护下能更长久的维持这种优势。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-9
1 文献综述  9-23
  1.1 地下害虫的概述  9-11
    1.1.1 分类研究和种类调查  9
    1.1.2 习性及危害方式  9
    1.1.3 几种地下害虫的生物生态学研究  9-10
    1.1.4 生物防治  10-11
  1.2 微菌核（MS）概述  11-14
    1.2.1 MS 的生物学特性  11-13
    1.2.2 昆虫病原真菌 MS 的诱导培养  13-14
  1.3 真菌杀虫剂研究现状  14-17
    1.3.1 昆虫病原真菌的特点及利用方式  14
    1.3.2 球孢白僵菌、布氏白僵菌和绿僵菌的研究概况  14-17
  1.4 真菌杀虫剂的生产应用  17-23
    1.4.1 主要真菌杀虫剂的生产  17-18
    1.4.2 主要真菌杀虫剂的生防应用  18-21
    1.4.3 真菌杀虫剂侵染体的研究  21-23
2 引言  23-25
3 材料与方法  25-30
  3.1 材料  25-26
    3.1.1 供试菌株  25
    3.1.2 培养基  25
    3.1.3 仪器设备与试剂耗材  25-26
  3.2 方法  26-30
    3.2.1 MS 的产生  26
    3.2.2 MS 生产的优化  26-28
    3.2.3 MS 制剂的储藏期的研究  28-30
4 结果与分析  30-64
  4.1 单因素实验筛选高产 MS 菌株  30-43
    4.1.1 碳源对 MS、芽孢产量和生物量累积的影响  30
    4.1.2 氮源对 MS、芽孢产量和生物量累积的影响  30
    4.1.3 吐温浓度对 MS、芽孢产量和生物量累积的影响  30-36
    4.1.4 碳源浓度对氮源对 MS、芽孢产量和生物量累积的影响  36
    4.1.5 碳氮比浓度对 MS、芽孢产量和生物量累积的影响  36-42
    4.1.6 小结  42-43
  4.2 MS 的生长模式  43-44
  4.3 非营养条件对 MS 发酵的影响  44-47
    4.3.1 接种量对 MS 产量及生物量的影响  44-45
    4.3.2 装液量对 MS 产量及生物量的影响  45-46
    4.3.3 转速对 Bbr17MS 产量及生物量的影响  46-47
  4.4 球孢白僵菌 Bb2729 菌株 MS 产量的条件优化  47-50
    4.4.1 碳氮比复筛  47
    4.4.2 进一步确定影响发酵结果的显著因子  47-49
    4.4.3 最陡爬坡实验确定响应面中心点  49
    4.4.4 中心复合实验  49-50
  4.5 布氏白僵菌 Bbr17 菌株 MS 产量的条件优化  50-53
    4.5.1 碳氮比复筛  50
    4.5.2 进一步确定影响发酵结果的显著因子  50-51
    4.5.3 最陡爬坡实验确定响应面中心点  51-52
    4.5.4 中心复合实验  52-53
  4.6 金龟子绿僵菌 Ma55 菌株 MS 产量的条件优化  53-57
    4.6.1 碳氮比复筛  53-54
    4.6.2 进一步确定影响发酵结果的显著因子  54
    4.6.3 最陡爬坡实验确定响应面中心点  54-56
    4.6.4 中心复合实验  56-57
  4.7 MS-DE 颗粒的复水复苏  57-58
    4.7.1 干燥 MS-DE 颗粒在水琼脂平板上复苏形态  57-58
    4.7.2 MS-DE 复苏产孢过程  58
  4.8 复水复苏后 MS-DE 的复苏率及分生孢子产量  58-60
  4.9 MS 的储藏实验  60-64
5 结论  64-66
6 讨论  66-67
参考文献  67-73
致谢  73-74
个人简介及在读期间发表的学术论文  74

几株昆虫病原菌微菌核的诱导培养和条件优化

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