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工业酿酒酵母菌株cdc15基因改造的研究

作　者: 晏伟
导　师: 黄日波
学　校: 广西大学
专　业: 发酵工程
关键词: 工业酿酒酵母 cdc15 基因同源重组 乙醇发酵 生长速率 高温耐受性
分类号: TS261.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


用于甘蔗糖蜜乙醇发酵的工业酿酒酵母MF1005高产乙醇,生长周期长；而酿酒酵母MC1415产酒率低,生长周期短。cdcl5基因在酿酒酵母的I号染色体上,编码的蛋白质Cdc15与酵母细胞生长周期有关,利用基因同源重组的原理,将MC1415中cdc15基因转入MF1005单倍体中,通过反复筛选获得稳定突变株,进一步利用PCR产物测序验证有突变位点,并命名该突变株为MF1005-cdcl5。为了检验MF1005-cdcl5发酵性能的变化及其遗传稳定性,本实验以MF1005-cdcl5接种0、10、20和30次,分别命名为MF1005-cdc15(GO、 G10、G20和G30),以这些菌株为材料,研究cdcl5突变对MF1005生理及蔗糖、糖蜜发酵的影响。结果显示：30℃培养条件下,MF1005-cdc15比MF1005提前8小时(16小时)菌体数达到最大值2.93-3.25×108/mL,是MF1005的1.3-1.5倍；37℃培养条件下,MF1005-cdcl5在24小时达到最大值2.68-3.08×108/mL,是MF1005的1.3-1.5倍。证明MF1005-cdc15突变株的生长速率比MF1005有提高。在高温耐受性实验中,在50℃、52℃、54℃下热击10min后发现,MF1005-cdc15明显比MF1005的高温耐受性能强,54℃下MF1005在平板中无菌落生长,而MF1005-cdc15仍有少数细胞存活。在25%蔗糖发酵中,30℃下MF1005-cdc15的乙醇产量比MF1005提高2.9%-4.0%；37℃下提高5.3%-6.2%。在糖蜜补料发酵中,30℃时MF1005-cdc15的乙醇产量高达15.31-15.43%(V/V)；37℃时乙醇产量为13.04%-13.22%(V/V),比MF1005增加17.69%-19.31%,MF1005-cdcl5比MF1005总糖的利用率提高0.26%.1.09%,说明突变株MF1005-cdc15的糖蜜乙醇发酵性能明显优于始发菌株MF1005。相对呼吸强度检测显示,cdcl5突变对MF1005的呼吸强度影响不大(MF1005-cdc15与MF1005比较下相对呼吸强度为92.6%-97.5%)。本研究可为探讨cdc15的功能以及乙醇发酵工业菌株改造、提高乙醇发酵效率和产量提供参考。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章 前言  11-25
  1.1 引言  11
  1.2 燃料乙醇  11-15
    1.2.1 乙醇概述  11-12
    1.2.2 燃料乙醇发展的国内外情况及意义  12-15
  1.3 糖蜜发酵产乙醇  15-18
    1.3.1 糖蜜的介绍  15
    1.3.2 糖蜜发酵乙醇的原理  15
    1.3.3 糖蜜发酵产乙醇的现状  15-16
    1.3.4 糖蜜发酵乙醇的意义及存在的问题  16-18
  1.4 酵母改造  18-22
    1.4.1 乙醇生产菌种  18
    1.4.2 酵母的改造  18-19
    1.4.3 传统育种  19
    1.4.4 现代育种  19-22
  1.5 本课题研究  22-25
    1.5.1 课题研究的目的、意义  22-23
    1.5.2 课题研究的内容  23
    1.5.3 实验创新点  23-24
    1.5.4 技术路线  24-25
第二章 材料与方法  25-34
  2.1 实验材料  25-26
    2.1.1 实验菌株  25
    2.1.2 培养基  25-26
    2.1.3 其他试剂  26
    2.1.4 主要仪器设备  26
  2.2 实验方法  26-34
    2.2.1 菌株活化及培养  26
    2.2.2 菌株保存  26-27
    2.2.3 酿酒酵母总DNA的提取  27
    2.2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳  27
    2.2.5 目的基因的克隆  27-28
    2.2.6 酵母转化  28-29
    2.2.7 筛选  29
    2.2.8 生长曲线测定  29-30
    2.2.9 相对呼吸强度测定  30-31
    2.2.10 高温耐受性实验  31
    2.2.11 蔗糖发酵实验  31-33
    2.2.12 糖蜜发酵实验  33
    2.2.13 糖分利用能力检测  33-34
第三章 结果与分析  34-54
  3.1 筛选育种  34-40
    3.1.1 生物学分子实验  34-36
    3.1.2 突变体的筛选  36-39
    3.1.3 突变体的验证  39-40
  3.2 突变体MF1005-cdc15的生长及相关的性能研究  40-54
    3.2.1 生长曲线测定  40-42
    3.2.2 相对呼吸强度测定  42-43
    3.2.3 糖分利用能力检测  43-44
    3.2.4 高温耐受性实验  44-47
    3.2.5 发酵实验  47-54
第四章 讨论  54-58
  4.1 构建菌株MF1005-cdc15及其优良发酵性状意义  54-57
    4.1.1 菌株MF1005-cdc15高温耐受性提高及其意义  54
    4.1.2 MF1005-cdc15的乙醇发酵性能提高及其意义  54-56
    4.1.3 突变株的遗传稳定性  56-57
  4.2 基因改造方法  57-58
第五章 结论与展望  58-60
  5.1 结论  58
  5.2 展望  58-60
参考文献  60-68
附录1  68-70
  一、试剂  68-69
  二、常用仪器  69-70
附录2  70-72
致谢  72-73
攻读学位期间发表的学术论文  73

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 酿造工业 > 酿酒工业 > 酿酒微生物
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