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酿酒酵母细胞中ScRCH1基因的功能和调控

作　者: 杜敬彩
导　师: 蒋伶活
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: 酿酒酵母 RCH1 SLC10A7 钙离子稳态转录因子
分类号: TS261.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的YMR034c基因编码的蛋白与人类溶质转运蛋白SLC10A7和白念珠菌蛋白CaRch1同源，因此将它命名为ScRCH1。将表达ScRCH1的pCR4-ScRCH1质粒，导入白念珠菌Carch1/Carch1双倍体缺失株中，表型互补实验证明酿酒酵母ScRCH1基因可以部分互补白念珠菌CaRCH1基因的功能。酿酒酵母细胞中，缺失了编码ER/Golgi钙泵的ScPMR1后，再缺失ScRCH1会降低细胞对钙离子的耐受性，这说明ScRch1和ScPmr1蛋白在调节细胞内钙离子稳态方面具有遗传互作。然而，细胞缺少编码液泡钙泵的ScPMC1后，再缺失ScRCH1不影响细胞对钙离子的敏感性，两者之间的关系有待我们进一步的研究。ScRch1受胞外高浓度钙离子胁迫的诱导表达，并定位在细胞质膜上。对ScRch1的C-端部分跨膜域进行缺失突变分析，结果表明ScRch1的C-端第九个跨膜区域对它的亚细胞定位是必需的。通过功能基因组学手段对酿酒酵母基因组中编码转录相关的223个基因进行系统筛选，发现INO2、NGG1、ADA2、HAL9、CRZ1和SWI66个基因的缺失影响ScRch1的表达和定位，它们与磷脂生物合成、组蛋白乙酰化和Na+泵基因ENA1的表达有关。通过构建的报告质粒进行β-半乳糖苷酶活性的测定，证明ScRCH1的表达受Crz1p的正调节作用。利用搭桥PCR技术，将ScRCH1启动子的钙调磷酸脂酶依赖性反应元件CDRE元件定点突变，并进行表达调控分析证明ScRCH1的转录是通过它启动子上的单一CDRE元件调控。这些结果为深入研究ScRch1在钙离子稳态调控方面的功能奠定了基础。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-5
目录  5-7
第一章绪论  7-13
  1.1 酵母及酿酒酵母  7-9
    1.1.1 酵母简介  7
    1.1.2 酿酒酵母  7-8
    1.1.3 酿酒酵母作为模式生物  8
    1.1.4 酿酒酵母基因缺失株文库  8-9
  1.2  9-11
    1.2.1 酿酒酵母细胞中钙离子信号途径简介  9-10
    1.2.2 钙调磷酸酶信号途径  10
    1.2.3 转录因子  10-11
  1.3 膜蛋白的跨膜域  11-12
  1.4 RCH1 基因相关研究  12
    1.4.1 SLC10A7 家族成员  12
    1.4.2 RCH1 基因的研究  12
  1.5 本课题研究的内容和意义  12-13
第二章实验材料与方法  13-26
  2.1 实验仪器与材料  13-19
    2.1.1 实验菌株和质粒  13-14
    2.1.2 实验所用生化试剂  14-15
    2.1.3 工具酶及相关试剂盒  15-16
    2.1.4 实验仪器  16-17
    2.1.5 实验所用溶液  17-18
    2.1.6 培养基的配制  18-19
  2.2 实验方法  19-26
    2.2.1 菌株的培养与保存  19
    2.2.2 倍比稀释法  19
    2.2.3 玻璃珠法提取酿酒酵母或白念珠菌基因组 DNA  19-20
    2.2.4 引物的设计  20
    2.2.5 PCR 扩增 DNA 片段  20-21
    2.2.6 乙醇沉淀法纯化 DNA 片段  21
    2.2.7 酿酒酵母的 DNA 片段的转化  21
    2.2.8 酿酒酵母质粒的转化  21-22
    2.2.9 白念珠菌质粒的转化  22
    2.2.10 碱裂解法质粒的小量提取  22
    2.2.11 酶切  22-23
    2.2.12 琼脂糖凝胶 DNA 回收  23
    2.2.13 连接  23-24
    2.2.14 连接产物或质粒转化 E.coli 感受态细胞  24
    2.2.15 荧光显微镜的观察  24
    2.2.16 β-半乳糖苷酶（lacZ）活性的测定  24-25
    2.2.17 数据库和基因分析软件  25-26
第三章实验结果与讨论  26-46
  3.1 ScRch1 蛋白结构与功能分析  26-29
    3.1.1 酿酒酵母 ScRch1 蛋白序列分析  26
    3.1.2 ScRch1 的蛋白功能分析  26-29
  3.2 ScRch1 在酿酒酵母细胞中的定位分析  29-40
    3.2.1 钙离子处理条件下 ScRch1-GFP 定位到细胞膜上  29-31
    3.2.2 ScRch1 蛋白跨膜域对 ScRch1 膜定位的影响  31-36
    3.2.3 酿酒酵母基因组中与 ScRch1 细胞质膜定位相关的转录因子基因的筛选  36-40
  3.3 Ca~(2+)对 ScRch1 表达的调控  40-46
    3.3.1 钙离子信号途径对钙离子稳态调控因子 ScRch1 细胞质膜定位的影响  40
    3.3.2 ScRCH1 的表达受 Crz1 的正调节作用  40-42
    3.3.3 Crz1 通过 ScRCH1 启动子上的 CDRE 序列进行正调控  42-45
    3.3.4 Rch1 和 Pmr1 在调节细胞内钙离子平衡机制中的共同作用  45-46
第四章主要结论与展望  46-48
  4.1 主要结论  46-47
  4.2 展望  47-48
致谢  48-49
参考文献  49-52
在学期间发表的论文和取得的学术成果清单  52

酿酒酵母细胞中ScRCH1基因的功能和调控

内容摘要

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