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同时检测黄曲霉素B1和桔青霉素的金标试纸制备技术研究

作　者: 伍鑫茹
导　师: 张焜
学　校: 五邑大学
专　业: 应用化学
关键词: 黄曲霉毒素B1 桔青霉素 免疫层析试纸条
分类号: TS207.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


黄曲霉毒素B1和桔青霉素属于真菌毒素,是由曲霉属、青霉属等真菌在生长过程中产生的一类次级代谢产物。通过污染谷物及动物性食品进入食物链,进而危害人类的肝脏和肾脏,对人类健康和国家安全构成了潜在的巨大威胁。研究制备同时检测黄曲霉毒素B1和桔青霉素的胶体金免疫层析技术,是快速检测生物毒素的主要发展趋势。本课题的主要研究内容和结论如下：1.分别通过N-羟琥珀酰亚胺酯法合成黄曲霉毒素B1人工抗原和活性酯法合成桔青霉素人工抗原。首先对合成的黄曲霉毒素B,半抗原和桔青霉素半抗原,通过紫外光谱法和高效液相色谱-质谱联用法进行分析表征,确定半抗原合成成功；采用可见分光光度法对偶联后的全抗原扫描鉴定,确定半抗原与载体蛋白偶联成功,并测定得到黄曲霉毒素B1人工抗原和桔青霉素人工抗原的偶联比分别为5.13：1和7.2：1。2.采用柠檬酸三钠还原法制备了胶体金颗粒,通过试验确定了胶体金标记的最适pH为添加了20μL/ml的0.1mol/L K2CO3溶液,最适抗体蛋白的用量为60μg/ml。分别用胶体金标记抗AFB1单克隆抗体和抗CIT单克隆抗体,制备了AFB1和CIT的免疫胶体金探针,并通过斑点金免疫渗滤实验证明了金标探针具有免疫活性。3.将AFB1人工抗原和CIT人工抗原作为包被抗原,分别固定在硝酸纤维素膜的检测线T1和检测线T2,将羊抗鼠二抗包被于硝酸纤维素膜上,作为质控线C线,组装了同时检测AFB1和CIT的胶体金免疫层析试纸条。初步探索试验条件,确定了制备试纸条的各个参数,对金标抗体的稀释液配方和稀释度数进行优化,并调试和确定,T1线上的AFB1包被抗原、T2线上CIT包被抗原以及C线上的二抗的最佳浓度。4.组装成试纸条后,对试纸条的各项指标进行优化。分别对系列浓度的AFB1和CIT标准液进行检测,确定试纸条的检出限为5ng/ml和50ng/ml。该试纸条对AFTB2、M1、玉米赤霉烯酮、伏马菌素等结构类似物无交叉反应,硅胶干燥后,4℃密封冷藏可保存三个月以上。5.试纸条同时快速检测两种毒素,灵敏度高,特异性强,操作简单方便,可用于现场的大批量快速检测。本研究为同时快速检测多种毒素的试纸条的研究奠定了基础。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章 绪论  10-23
  前言  10-11
  1.1 黄曲霉毒素B_1概述  11-13
    1.1.1 黄曲霉毒素B_1的物理和化学性质  11
    1.1.2 黄曲霉毒素B_1的毒性和危害  11-12
    1.1.3 黄曲霉毒素B_1的限量标准及检测  12-13
  1.2 桔青霉素概述  13-16
    1.2.1 桔青霉素的物理和化学性质  13-14
    1.2.2 桔青霉素的毒性和危害  14
    1.2.3 桔青霉素的限量标准及检测  14-16
  1.3 胶体金免疫层析技术  16-21
    1.3.1 胶体金的特性及制备  16-17
    1.3.2 金标免疫层析的检测原理  17-19
    1.3.3 胶体金免疫层析技术的应用  19-20
    1.3.4 胶体金免疫层析技术的优点及发展前景  20-21
  1.4 本课题的意义及主要研究内容  21-23
    1.4.1 本课题的研究意义  21
    1.4.2 本课题的主要研究内容  21-23
第二章 AFB_1人工抗原的合成与鉴定  23-33
  前言  23
  2.1 材料与方法  23-25
    2.1.1 实验试剂与仪器  23-24
    2.1.2 常用溶液的配制  24
    2.1.3 透析袋的处理  24-25
  2.2 实验方法  25-27
    2.2.1 AFB_1O的合成  25
    2.2.2 AFB_1完全抗原的合成  25-26
    2.2.3 AFB_1半抗原和完全抗原的鉴定  26
    2.2.4 AFB_1抗原结合比的测定  26-27
  2.3 结果与分析  27-31
    2.3.1 半抗原的鉴定  27-29
    2.3.2 完全抗原的紫外扫描  29
    2.3.3 完全抗原偶联比的测定  29-31
  2.4 小结与讨论  31-33
    2.4.1 小结  31
    2.4.2 讨论  31-33
第三章 CIT完全抗原的合成及鉴定  33-43
  前言  33
  3.1 材料与方法  33-35
    3.1.1 实验试剂与仪器  33-34
    3.1.2 常用溶液的配制  34-35
    3.1.3 透析袋的处理  35
  3.2 实验方法  35-37
    3.2.1 CIT活性酯的合成  35
    3.2.2 CIT完全抗原的合成  35-36
    3.2.3 CIT半抗原和完全抗原的鉴定  36
    3.2.4 CIT完全抗原结合比的测定  36-37
  3.3 结果与分析  37-41
    3.3.1 CIT半抗原的鉴定  37-39
    3.3.2 CIT完全抗原的鉴定  39
    3.3.3 完全抗原偶联比的测定  39-41
  3.4 小结与讨论  41-43
    3.4.1 小结  41-42
    3.4.2 讨论  42-43
第四章 金标免疫层析试纸条的建立  43-59
  前言  43
  4.1 材料与方法  43-44
    4.1.1 实验试剂与仪器  43-44
    4.1.2 常用溶液的配制  44
  4.2 实验方法  44-49
    4.2.1 胶体金的制备  44-45
    4.2.2 金标抗体探针的制备  45-47
    4.2.3 免疫层析试纸条的制备  47-48
    4.2.4 试纸条性能的测定  48-49
  4.3 结果与分析  49-56
    4.3.1 胶体金的鉴定  49-51
    4.3.2 胶体金标记抗体  51-53
    4.3.3 胶体金试纸组装  53-54
    4.3.4 试纸条的性能测试  54-56
  4.4 讨论与小结  56-59
    4.4.1 小结  56
    4.4.2 讨论  56-59
结论  59-61
参考文献  61-66
硕士期间撰写和发表的论文情况  66-67
致谢  67

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 食品标准与检验 > 食品污染度的测定
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