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美花石斛优势内生菌根真菌生物学特性及其分子鉴定

作　者: 李瑛婕
导　师: 李绍鹏
学　校: 海南大学
专　业: 园林植物与观赏园艺
关键词: 美花石斛优势内生菌根真菌真菌生物学特征形态学鉴定 ITS序列分析
分类号: S567.239
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本研究以中国药用石斛广布种美花石斛(Dendrobium loddigesii)内生菌根真菌为研究对象,采用形态和分子生物学方法鉴定其优势内生菌根真菌,探讨内生菌根真菌和兰科植物对温度、水分胁迫的响应机制,以此来了解我国不同地区、不同气候带的兰科植物菌根真菌在不同生态条件下的应对机制,为濒危兰科植物的保育提供理论基础和和技术保障。本文就不同温度、水分胁迫和pH条件下,对从美花石斛优势内生菌根真菌进行了生态特征研究,并对其在适温下PDA培养基上的培养特征与形态学特征进行了观察,使用分子生物学技术并结合形态学观察的方法鉴定出实验选用菌株。主要研究结果如下：美花石斛优势菌根真菌在5℃条件下,菌株停止生长。当温度达到10℃时,真菌开始恢复生长,其生长速度随着温度的增加而不断加快,但生长速度的增加较为平缓;当温度达到最适宜温度(25℃或28℃),各菌株生长速度达到最大；当温度超过最适宜温度,除F12和B28外,菌株的生长速度会随着温度的增加而缓慢下降。真菌大多可在15-35℃维持正常生长,适宜生长的温度范围广,温度生长曲线呈缓平形或宽顶形,因此这些真菌在自然条件下具有较强的适应能力。在中性至偏碱性(pH在7-9之间)培养基中也普遍生长良好,生长量差异不显著。真菌对酸性培养基的耐受程度相差较大,仅F13可耐受pH 4的酸性环境,F24a、F24b可在pH 5条件下生长,F12、F14和F23可在pH≥6的条件下生长,B28对酸性环境的耐受性较低,只能在中碱性环境下生存。在所有的供试菌根真菌中,全部菌根真菌在pH4条件下,菌落直径到达最小值,多数真菌没有生长迹象或只有极少菌丝生长。美花石斛优势菌根真菌均对碱性环境条件适应性较强。F13和F23对PEG的适应性最广,其在PEG浓度30%以内均可生长,但其生长速度随着PEG浓度的升高而逐渐降低。且F23在PEG 20%条件下的菌落直径最大。B28对PEG的适应范围最窄,只能耐受PEG 10%以下的条件。除F12和B28外,其余菌株均能在PEG 25%条件下生长,且随着PEG浓度的升高,菌株的生长速度逐渐下降。PEG模拟水分胁迫试验结果表明,较弱的水分胁迫对7种内生菌根菌的生长没有影响,有的甚至有所促进;但是,当PEG浓度达到30%时(-1.53 MPa),多数内生菌根菌的生长完全受到限制。因此可以推测,当土壤含水量低于一定值时,内生菌根菌的生长将被完全抑止。实验采用不同培养基、高低温交替培养、紫外光／散射光交替培养、低温诱导等方法诱导真菌产孢,但只有一株真菌产生孢子。由于在实验室环境下很难诱导产生无性孢子或子实体,因此兰科菌根真菌难以获得可作为分类依据的形态学和解剖学的特征。对11株分离、筛选自不同地理分布和附生基质的美花石斛优势内生菌根真菌进行了rDNA ITS序列多样性分析。结果显示：本次实验鉴定出的真菌,分属于子囊菌亚门(6种),担子菌亚门(2种),有丝分裂孢子真菌(1种),共3科、4属,分别是美孢胶膜菌Tulasnella calospora,瘤菌根菌Epulorhiza,顶孢霉A cremonium alternatum,烧瓶状霉Lecythophora和美孢胶膜菌T. Calospora(对应的无性态为瘤菌根菌, anamorph: Epulorhiza repens)地理因素是进一步深入研究兰科植物——菌根真菌共生体的关键因素,影响兰科植物共生真菌的多样性及专一性；产地环境的复杂程度直接影响兰科植物菌根真菌的多样性,生境比较复杂的兰科植物其真菌多样性更强；兰科植物对与之共生的菌根真菌有很强的专一性,但真菌并没有体现对某种兰科植物的专一性。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
1 绪论  11-24
  1.1 兰科植物内生菌根真菌研究  11-18
    1.1.1 内生真菌对兰科植物生理效应的研究  11-13
    1.1.2 兰科植物内生真菌对提高兰科植物抗逆性的研究  13-16
    1.1.3 内生真菌对提高兰科植物抗逆性的可能机制  16-18
  1.2 兰科植物内生真菌生物学特性研究  18-20
  1.3 兰科植物内生真菌鉴定技术与方法  20
  1.4 本研究的选题依据  20-23
    1.4.1 研究目的、意义  20-21
    1.4.2 美花石斛研究背景  21-23
  1.5 研究内容与研究方案  23-24
    1.5.1 研究内容  23
    1.5.2 技术路线  23-24
2 生态因子对菌根真菌生长的影响  24-43
  2.1 材料与方法  24-26
    2.1.1 待研究菌株  24-25
    2.1.2 培养基  25
    2.1.3 培养方法  25-26
  2.2 结果与分析  26-39
    2.2.1 温度对菌株生长的影响  26-31
    2.2.2 pH值对菌根真菌生长的影响  31-35
    2.2.3 水势对菌根真菌生长的影响  35-39
  2.3 讨论  39-41
  2.4 本章小结  41-43
3 培养特征与形态学特征观察  43-48
  3.1 材料与方法  43-45
    3.1.1 待鉴定菌株  43-44
    3.1.2 观察描述方法  44-45
    3.1.3 诱导产孢  45
    3.1.4 显微摄影  45
    3.1.5 菌种的鉴定  45
  3.2 结果与分析  45-46
  3.3 讨论  46-48
4 美花石斛内生真菌的分子鉴定  48-56
  4.1 材料与方法  48-51
    4.1.1 待鉴定菌株  48-49
    4.1.2 试剂与仪器  49
    4.1.3 DNA提取材料的获得  49-50
    4.1.4 引物合成与扩增体系  50-51
    4.1.5 PCR产物检测  51
    4.1.6 序列测定  51
    4.1.7 序列分析  51
  4.2 结果与分析  51-54
    4.2.1 rDNA ITS区段的PCR扩增及检测结果  51-52
    4.2.2 rDNA ITS序列的Blast比对结果  52
    4.2.3 rDNA ITS序列聚类结果  52-54
  4.3 讨论  54-55
  4.4 本章小结  55-56
5 结论与展望  56-58
  5.1 主要结论  56-57
  5.2 展望  57-58
参考文献  58-68
致谢  68-69
附录  69-70
图版  70-76

美花石斛优势内生菌根真菌生物学特性及其分子鉴定

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