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生物功能化微纳米材料的制备与蛋白质的亲和分离

作　者: 邹雪艳
导　师: 赵彦保
学　校: 河南大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 生物功能化无机微纳米材料制备蛋白质亲和分离
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

本文采用SiO₂、FeOOH及Fe₃O₄三种微纳米材料为载体，对其表面进行生物功能化，并利用它们对谷胱甘肽S-转移酶（GST）及六聚组氨酸为标签的（His-tagged）蛋白进行分离、纯化，采用多种现代分析手段对所得样品的形貌、结构及性能进行了表征，并对其亲和分离蛋白质的能力进行了研究。本论文的主要研究内容及结论如下：（1）纳米SiO₂的制备和生物功能化及其在GST分离中的应用通过正硅酸乙酯（TEOS）的水解制备了三种不同形貌的纳米SiO₂（哑铃形、纤维状、链状）；考察了TEOS的加入方式、氨水浓度及TEOS浓度对样品形貌的影响，并分析了其形成机理。进而以球形纳米SiO₂为载体，通过对其表面进行氨基化、醛基化及生物功能化，制备了对GST具有特异性吸附的SiO₂-GSH纳米微球；采用扫描电子显微镜（SEM）、紫外可见分光光度计（UV-Vis）、热重分析仪（TG）、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析测定了SiO₂-GSH纳米微球的形貌、结构及分离蛋白质的能力。结果表明，SiO₂-GSH微球可用于GST的初步分离与纯化。（2）巯基SiO₂纳米微球的制备及其在GST分离中的应用采用巯基丙基三甲氧基硅烷（MPS）一步水解法制备了表面带有巯基（―SH）的SiO₂纳米微球（nSiO₂-SH），探讨了水醇比、反应温度、MPS初始浓度及反应时间对nSiO₂-SH形貌的影响，并分析了反应机理；采用二硫代二硝基苯甲酸法（DTNB法）和X-射线光电子能谱仪（XPS）定量检测了微球表面的―SH含量，发现微球表面的―SH含量与反应条件密切相关。进而利用nSiO₂-SH微球与还原型谷胱甘肽（GSH）中的―SH反应生成双硫键（―S―S―），在nSiO₂-SH微球表面键合GSH分子，得到生物功能化的纳米SiO₂微球（nSiO₂-GSH）；利用SEM、TEM、FT-IR分析了nSiO₂-GSH微球的表面形貌、尺寸、化学结构，利用热重分析测定了其热稳定性；并利用SDS-PAGE检测了样品对GST的分离效果。结果表明，nSiO₂-GSH微球能从混合蛋白中特异性地分离GST，这种微球可望用于以GST为标签的融合蛋白的分离、纯化及检测。（3）花瓣状FeOOH/Cys的合成及其在His-tagged蛋白分离纯化中的应用采用一步法制备了L-半胱氨酸（L-Cys）功能化的FeOOH/Cys微纳米复合材料，将其吸附Ni²⁺后用于分离His-tagged融合蛋白；考察了FeOOH/Cys的初始质量和细胞裂解液的初始体积等对目标蛋白分离效果的影响。结果表明，FeOOH/Cys微纳米复合材料对His-tagged融合蛋白具有良好的分离作用，对His-tagged OST1蛋白的最大吸附量为88.0μg/mg；且其经4次再生后仍能有效地分离目标蛋白。（4）Fe₃O₄/Cys纳米微球的制备及其在His-tagged蛋白分离纯化中的应用利用一步溶剂热法制备了L-Cys功能化的Fe₃O₄磁性纳米微球（Fe₃O₄/Cys），Fe₃O₄/Cys微球经吸附Ni²⁺形成Fe₃O₄/Cys-Ni²⁺复合材料；系统考察了Fe₃O₄/Cys-Ni²⁺复合微球对His-tagged融合蛋白的分离纯化效果。结果表明，其对His-tagged TRX蛋白的最大吸附量达53.2μg/mg，分离能力良好；且其再生力较强，经多次再生后依然保持良好的分离效果。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-12
第一章绪论  12-26
  1.1 非金属氧化物纳米材料  13-15
    1.1.1 纳米二氧化硅  13-14
    1.1.2 纳米介孔分子筛  14-15
  1.2 碳纳米管  15
  1.3 金属氧化物纳米材料  15-16
  1.4 金属纳米材料  16-17
  1.5 纳米聚合物  17-18
  1.6 纳米复合材料  18
  1.7 选题意义  18-19
  1.8 主要研究内容  19-20
  参考文献  20-26
第二章纳米 SiO_2的制备和生物功能化及其在 GST 分离中的应用  26-38
  2.1 实验部分  26-28
    2.1.1 试剂与仪器  26-27
    2.1.2 纳米 SiO_2的制备与功能化  27
    2.1.3 GST 分离  27-28
  2.2 结果与讨论  28-34
    2.2.1 反应条件的影响  28-31
    2.2.2 形成机理  31-32
    2.2.3 紫外可见吸收光谱  32
    2.2.4 热重分析  32-33
    2.2.5 电泳结果  33-34
  2.3 结论  34-35
  参考文献  35-38
第三章巯基 SiO_2纳米微球的制备及其在 GST 分离中的应用  38-50
  3.1 实验部分  38-40
    3.1.1 试剂与仪器  38-39
    3.1.2 nSiO_2-SH 微球的制备与功能化  39
    3.1.3 nSiO_2-GSH 微球对 GST 纯化  39-40
  3.2 结果与讨论  40-46
    3.2.1 不同条件对 nSiO_2-SH 形貌的影响  40-43
    3.2.2 nSiO_2-GSH 微球的表征  43-45
    3.2.3 SDS-PAGE 分析  45-46
  3.3 结论  46-47
  参考文献  47-50
第四章 SiO_2表面官能团的定量分析及其在 GST 分离中的应用  50-62
  4.1 实验部分  50-52
    4.1.1 试剂与仪器  50-51
    4.1.2 SiO_2-SH 微球的制备  51
    4.1.3 SiO_2-SH 微球与 GSH 的键合  51
    4.1.4 SiO_2-SH 微球中巯基含量的定量检测  51
    4.1.5 GST 的分离与检测  51-52
  4.2 结果与讨论  52-58
    4.2.1 SiO_2-SH 微球的表征  52-56
    4.2.2 SiO_2-GSH 微球的表征  56-57
    4.2.3 SiO_2-GSH 微球分离 GST  57-58
  4.3 结论  58-59
  参考文献  59-62
第五章花瓣状 FeOOH/Cys 的合成及其在 His-tagged 蛋白分离纯化中的应用  62-74
  5.1 实验部分  62-64
    5.1.1 试剂与仪器  62-63
    5.1.2 FeOOH/Cys 复合材料的制备  63
    5.1.3 FeOOH/Cys-Ni~(2+)复合材料的制备  63
    5.1.4 His-tagged 融合蛋白的制备及分离  63-64
  5.2 结果与讨论  64-70
  5.3 结论  70-71
  参考文献  71-74
第六章 Fe_3O_4/Cys 纳米微球的制备及其在 His-tagged 蛋白纯化中的应用  74-86
  6.1 实验部分  74-75
    6.1.1 试剂与仪器  74-75
    6.1.2 Fe_3O_4/Cys 的制备  75
    6.1.3 Fe_3O_4/Cys-Ni~(2+)复合材料的制备  75
    6.1.4 His-tagged 蛋白的制备及分离  75
  6.2 结果与讨论  75-83
  6.3 结论  83-84
  参考文献  84-86
结束语  86-90
  7.1 主要结论  86-87
  7.2 问题和展望  87-90
致谢  90-92
攻读学位期间发表的学术论文目录  92-93

生物功能化微纳米材料的制备与蛋白质的亲和分离

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