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云芝胞内糖肽液体发酵及提取工艺的优化

作　者: 李渊
导　师: 张晓梅
学　校: 江南大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 云芝胞内糖肽鉴定发酵提取
分类号: TQ461
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

云芝是重要的药用真菌，云芝胞内糖肽因具有免疫增强、保肝和辅助癌症治疗等药理活性而成为一种重要的原料药。液体发酵生产云芝及其胞内糖肽在质量控制、自动化程度、生产强度等方面具有明显的优势，故有必要筛选优良菌株并优化发酵条件和提取工艺提高发酵产量和产物提取得率，并需考察工艺对产物的影响。本论文的主要工作内容如下：（1）通过基因组ITS和18S rDNA序列的测定、比对和构建系统进化树对菌株进行了分子鉴定，四株菌都鉴定为云芝（Trametes versicolor）。比较了四株菌的平板菌落形态、生长特性、发酵性能、胞内糖肽主要成分的含量和分子量分布，结果表明JNPF-CV05不论是在菌落形态、菌丝平均生长速度，还是在发酵产量及批次稳定性、胞内糖肽的主要指标都显示出是优良的菌株，适合做进一步发酵优化研究。（2）通过单因素和正交设计优化了云芝菌丝体和胞内糖肽的发酵培养基和培养条件，得到最佳发酵培养基：赤砂糖40g/L，玉米粉20g/L，胰蛋白胨6g/L，麸皮10g/L，磷酸二氢钾1g/L，结晶硫酸镁1g/L，葵花籽油1%（v/v）；最佳培养条件：初始pH为自然pH（约5），转速200rpm，接种量15%（v/v），温度28℃。优化后的生物量为24.12g/L，胞内糖肽产量为1.39g/L，相比优化前的生物量提高了1.2倍，胞内糖肽产量提高了71.6%。（3）对发酵优化前后条件下制备的云芝胞内糖肽的性质做了初步研究。结果显示，优化前和优化后的胞内糖肽总糖含量分别为55.2%、56.17%；优化前和优化后的胞内糖肽肽含量分别为21.7%、28.6%，优化前的胞内糖肽主峰分子量为1873.0kDa，保留时间为16.1min，而发酵优化后的胞内糖肽分子量分布与优化前的有明显差异。红外图谱显示糖肽含有吡喃多糖，优化前后的胞内糖肽官能团特征无明显差别。单糖组成显示糖肽糖类组分由7种单糖组成，葡萄糖是主要单糖。氨基酸组成显示糖肽蛋白组分由18种氨基酸组成，天冬氨酸和谷氨酸含量最多。优化后与优化前相比，单糖种类和氨基酸种类没有改变，但相对含量有所变化。（4）以云芝胞内糖肽提取得率作为指标，通过单因素实验优化了微波提取法和热水浸提法的操作条件。结果表明，微波提取最佳条件为：时间2min，功率264W，液固比20:1，提取2次；热水浸提最佳条件为：温度60℃，时间1.5h，液固比30:1，提取2次。对于鼓风、真空和冷冻条件下干燥制备的云芝菌丝体，在微波提取的最佳条件下的得率依次为：9.03%、9.28%、10.36%；在热水浸提的最佳条件下的得率依次为：8.56%、9.12%、9.53%。冷冻干燥后的菌丝体提取得率最高。微波提取较热水浸提显著缩短了提取时间，节省了提取溶剂用量，提取得率有所提高，且与热水浸提法提取的胞内糖肽的官能团特征相似。两种提取方法所得糖肽的主要指标都符合国家标准。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-6
目录  6-9
第一章绪论  9-18
  1.1 云芝概述  9-11
    1.1.1 云芝的分类及学名  9
    1.1.2 云芝的形态特征  9
    1.1.3 云芝的分布  9-10
    1.1.4 云芝的人工培养  10-11
  1.2 云芝胞内糖肽研究概述  11-15
    1.2.1 云芝胞内糖肽的研究背景  11-13
    1.2.2 云芝胞内糖肽的提取  13
    1.2.3 云芝胞内糖肽的理化性质、组成及分子量  13-14
    1.2.4 云芝胞内糖肽的主要生物活性  14-15
  1.3 药食用菌液态发酵优化研究进展  15-16
    1.3.1 传统优化法  15
    1.3.2 添加天然产物提取物  15-16
    1.3.3 补料分批发酵  16
    1.3.4 pH 控制  16
    1.3.5 溶氧控制  16
  1.4 立题背景及研究意义  16
  1.5 主要研究内容  16-18
第二章云芝菌株的鉴定及筛选  18-31
  2.1 引言  18
  2.2 实验材料  18-19
    2.2.1 菌株  18
    2.2.2 主要试剂和试剂盒  18
    2.2.3 主要仪器  18-19
  2.3 实验方法  19-22
    2.3.1 菌株的分子生物学鉴定方法  19-20
    2.3.2 培养基及培养条件  20-21
    2.3.3 生物量的测定  21
    2.3.4 胞内糖肽产量的测定  21
    2.3.5 胞内糖肽分子量分布的测定  21
    2.3.6 胞内糖肽总糖含量的测定  21-22
    2.3.7 胞内糖肽肽含量的测定  22
  2.4 结果和讨论  22-30
    2.4.1 菌株的分子鉴定  22-25
    2.4.2 菌株平板形态观察与生长比较  25-26
    2.4.3 菌株发酵性能的比较  26-27
    2.4.4 菌株胞内糖肽的比较  27-30
  2.5 本章小结  30-31
第三章云芝菌丝体及胞内糖肽发酵条件的优化  31-43
  3.1 引言  31
  3.2 实验材料  31-32
    3.2.1 菌株  31
    3.2.2 主要试剂  31
    3.2.3 主要仪器  31-32
  3.3 实验方法  32-33
    3.3.1 培养基及培养条件  32
    3.3.2 生物量的测定  32
    3.3.3 胞内糖肽产量的测定  32-33
  3.4 结果和讨论  33-42
    3.4.1 种子培养基的筛选  33
    3.4.2 发酵培养基的优化  33-39
    3.4.3 发酵培养条件的优化  39-41
    3.4.4 添加植物油对发酵的影响  41
    3.4.5 发酵优化前后产量的比较  41-42
  3.5 本章小结  42-43
第四章云芝胞内糖肽性质及提取工艺的初步研究  43-56
  4.1 引言  43
  4.2 实验材料  43-44
    4.2.1 胞内糖肽及菌粉  43
    4.2.2 主要试剂  43
    4.2.3 主要仪器  43-44
  4.3 实验方法  44-45
    4.3.1 颜色反应  44
    4.3.2 总糖含量的测定  44
    4.3.3 肽含量的测定  44
    4.3.4 分子量分布的测定  44
    4.3.5 红外图谱分析  44
    4.3.6 单糖组成分析  44
    4.3.7 氨基酸组成分析  44-45
    4.3.8 微波法制备胞内糖肽  45
    4.3.9 热水浸提法制备胞内糖肽  45
  4.4 结果与讨论  45-54
    4.4.1 胞内糖肽性质的初步研究  45-50
    4.4.2 两种提取工艺比较的初步研究  50-54
  4.5 本章小结  54-56
主要结论与展望  56-58
  主要结论  56-57
  存在的不足及展望  57-58
致谢  58-59
参考文献  59-63
附录 A: 作者在攻读硕士学位期间发表的论文  63-64
附录 B: 菌株相关序列  64-66

云芝胞内糖肽液体发酵及提取工艺的优化

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