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天然产物活性成分快速分离分析研究

作　者: 张宇平
导　师: 刘又年
学　校: 中南大学
专　业: 应用化学
关键词: 活性成分快速筛选高效液相色谱高速逆流色谱药物-药物靶标结合药物相互作用
分类号: O657.7
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

天然产物有效成分是其发挥药效作用的物质基础,对评价中药材的质量、制定中药质量控制标准、优化制剂工艺、揭示中药作用机制、实现中药现代化具有重要意义。天然产物成分复杂,传统的成分分离-活性筛选模式虽已阐明多种天然产物活性成分,但是这样的分离分析周期长,而且经常会随着逐步分离纯化有效部位的活性越来越弱,最后可能得不到有活性的单体成分,特别是结构不稳定的微量活性成分。因此建立快速分离分析复杂体系中活性化合物的方法势在必行。在本论文中,建立了一系列以高效液相色谱和高速逆流色谱为核心的方法,实现了天然产物复杂体系中活性成分的快速筛选、分析以及快速靶向分离制备研究。研究内容主要包括以下几个部分：(1)将HPLC-DPPH-MS/MS联用技术用于快速筛选和识别蒙古蒲公英中抗氧化活性成分。从蒙古蒲公英的醇提物中分析和鉴定了32个具有清除自由基活性的化合物：16个黄酮类衍生物,10个苯丙素类衍生物以及6个羟基苯甲酸类化合物,其中化合物9(isoetin-7-O-β-D-gluco-pyranosyl-2’-O-α-L-arabinopyranoside)、10(isoetin-7-O-β-D-glucopyranosyl-2’-O-α-D-glucopyranoside)和30(mongolicumin A)为新化合物,并首次使用逆流色谱导向分离制备三个新化合物。(2)建立DPPH/HPLC筛选技术,从中华卷柏乙酸乙酯部位中筛选出8个抗氧化活性成分。采用正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水(8:8:9:7, v/v/v/v)体系首次对8个目标化合物进行HSCCC同时制备分离,其中芹菜素和4’-O-甲基-罗伯茨双黄酮为首次从中华卷柏中分离得到。(3)同时建立DPPH/HPLC离线筛选技术,HPLC-DPPH在线筛选技术和HPLC/DPPH离线筛选技术,比较三种活性筛法方法在快速识别葛花提取液中抗氧化活性成分的差异,三种方法均无需对复杂体系进行预处理,但是DPPH/HPLC技术比其他两种方法具备较高的灵敏度和分辨率且对HPLC中色谱峰的分辨率要求不高。根据活性筛选结果,使用梯度洗脱、固定相推出、循环洗脱等多种模式的HSCCC技术导向制备18个不同极性不同含量的目标异黄酮类活性化合物,其中10个化合物(1个新化合物)为首次从葛花中分离得到。(4)采用离心超滤/HPLC方法快速筛选出杜仲中与BSA有相互作用的6个活性成分,并使用HSCCC技术导向分离制备6个目标活性化合物。通过荧光分光光度法测定了6个目标化合物以及混合物体系与BSA的相互作用,阐明了活性成分间的相互作用机理：京尼平苷酸单独存在时与BSA无相互作用,而当复杂体系中有绿原酸等化合物存在时,京尼平苷酸与绿原酸等化合物之间发生氢键作用生成京尼平苷酸-绿原酸复合物,从而发生化合物之间的相互作用,使得绿原酸等化合物与BSA的结合浓度降低,而京尼平苷酸表现为一定的结合作用。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
第一章绪论  11-25
  1.1 引言  11-12
  1.2 基于HPLC和活性筛选结合的天然产物中活性成分筛选方法  12-13
  1.3 活性成分筛选-HPLC分析  13-18
    1.3.1 自由基反应-HPLC分析  13-14
    1.3.2 生物大分子结合-HPLC分析  14-16
    1.3.3 生物色谱法  16-17
    1.3.4 血清药理学  17-18
  1.4 HPLC分析-活性成分筛选  18-20
    1.4.1 HPLC分析-离线活性筛选  18-19
    1.4.2 HPLC分析-在线活性筛选  19-20
  1.5 HSCCC分离天然产物活性化合物的研究进展  20-23
    1.5.1 HSCCC的特点  20-21
    1.5.2 HSCCC溶剂体系的选择  21-22
    1.5.3 HSCCC在天然产物分离中的应用  22-23
  1.6 选题背景及研究意义  23-25
第二章 HPLC-DPPH/HSCCC法分离分析蒙古蒲公英中活性成分  25-47
  2.1 引言  25-26
  2.2 HPLC-DPPH-ESI/MS联用技术  26-35
    2.2.1 实验部分  26-28
    2.2.2 结果与讨论  28-35
  2.3 HSCCC分离新型活性化合物  35-45
    2.3.1 实验部分  35-37
    2.3.2 结果与讨论  37-45
  2.4 本章小结  45-47
第三章 DPPH/HPLC/HSCCC法分离分析中华卷柏中活性成分  47-57
  3.1 引言  47-48
  3.2 实验部分  48-49
    3.2.1 材料、试剂与仪器  48
    3.2.2 中华卷柏粗提物的制备  48
    3.2.3 DPPH自由基清除活性测定  48
    3.2.4 DPPH-HPLC实验  48
    3.2.5 HSCCC靶向分离  48-49
    3.2.6 目标活性化合物的分析与鉴定  49
  3.3 结果与讨论  49-54
    3.3.1 中华卷柏不同部位的抗氧化活性  49-50
    3.3.2 DPPH-HPLC分析  50-51
    3.3.3 HSCCC制备分离  51-53
    3.3.4 HSCCC流分的纯度检测和结构鉴定  53
    3.3.5 八个制备分离的化合物抗氧化活性  53-54
  3.4 本章小结  54-57
第四章基于HPLC和DPPH的葛花活性成分分离分析比较研究  57-79
  4.1 引言  57-58
  4.2 DPPH/HPLC,HPLC-DPPH,HPLC/DPPH比较分析  58-68
    4.2.1 实验部分  58-61
    4.2.2 结果与讨论  61-68
  4.3 HSCCC系统分离活性化合物  68-77
    4.3.1 实验部分  68-70
    4.3.2 结果与讨论  70-77
  4.4 本章小结  77-79
第五章离心超滤/HPLC/HSCCC法分离分析杜仲叶中活性成分  79-97
  5.1 引言  79-80
  5.2 离心超滤/HPLC-DAD-MS/MS筛选杜仲叶中BSA结合的活性物质  80-84
    5.2.1 实验部分  80-81
    5.2.2 结果与讨论  81-84
  5.3 HSCCC导向分离活性化合物  84-90
    5.3.1 实验部分  84-86
    5.3.2 结果与讨论  86-90
  5.4 杜仲叶中活性成分与BSA相互作用研究  90-95
    5.4.1 实验部分  90-91
    5.4.2 结果与讨论  91-95
  5.5 本章小结  95-97
第六章总结与展望  97-101
参考文献  101-116
附录  116-123
致谢  123-125
攻读学位期间主要的研究成果  125-127

天然产物活性成分快速分离分析研究

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