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聚赖氨酸基非病毒载体的设计与制备

作　者: 周德重
导　师: 张政朴
学　校: 南开大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 非病毒基因载体聚赖氨酸多功能聚合物非静电组装
分类号: O631.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

本文开展了利用结构明确含糖和组氨酸甲酯结构单元多功能聚合物修饰的聚赖氨酸（PLL）基非病毒基因载体的研究。首先，利用可逆加成断裂链转移（RAFT）自由基聚合方法合成了不同分子链长的含糖聚合物（DPMAEL），然后通过共价接枝的方法将其引入到PLL上，得到PLL-g-DPMAEL。通过优化DPMAEL的链长和接枝度，调节PLL的聚阳离子性质。在降低PLL过高的连续正电荷密度的同时保留其良好的质粒DNA （pDNA）压缩和保护能力，调节PLL-g-DPMAEL/pDNA复合物纳米粒子与细胞之间的相互作用而改善PLL的基因转染效率。NIH3T3和HepG2细胞的体外转染试验证明PLL-g-DPMAEL具有非常低的细胞毒性，能有效压缩pDNA形成稳定的PLL-g-DPMAEL/pDNA复合物纳米粒子，PLL-g-DPMAEL与pDNA之间具有适当的静电相互作用强度，能及时将pDNA从复合物纳米粒子中释放出来。相对于PLL/pDNA，PLL-g-DPMAEL/pDNA复合物纳米粒子的基因转染效率明显提高。我们又进一步利用RAFT方法将具有质子缓冲能力的组氨酸甲酯单体与含乳糖单体共聚得到了P(His-co-DMAEL)。通过非静电组装的方法将P(His-co-DMAEL)，PLL和pDNA组装成PLL/DNA/P(His-co-DMAEL)三元复合物纳米粒子，考察了其在电解质、酶以及血清中的稳定性和抗聚集能力。结果表明，PLL/DNA/P(His-co-DMAEL)三元复合物纳米粒子具有非常好的稳定性和抗聚集能力。NIH3T3，HeLa和HepG2细胞的体外转染试验证明，在血清条件下，PLL/DNA/P(His-co-DMAEL)三元复合物纳米粒子具有较高的细胞内吞效率和基因转染效率。最后，我们分别使用共价接枝法和非静电组装法将P(His-co-DMAEL)引入到PLL/pDNA复合物纳米粒子中，对比了P(His-co-DMAEL)的引入方法对PLL/pDNA的性质和基因转染效率的影响。结果表明，采用共价接枝法，P(His-co-DMAEL)的量会对PLL/pDNA的性质及基因转染效率产生截然不同的影响。P(His-co-DMAEL)的量较少时能极大地改善PLL/pDNA的性质，提高其基因转染效率。而P(His-co-DMAEL)的量较多时会影响PLL对pDNA压缩能力而影响PLL/pDNA的基因转染效率。采用非静电组装法，P(His-co-DMAEL)的量越多，PLL/pDNA的性质改善越明显，基因转染效率越高。这些结果表明，用DPMAEL及P(His-co-DMAEL)修饰后的PLL在临床基因治疗上具有很大的应用潜力。

全文目录

摘要  5-8
Abstract  8-15
第一章绪论  15-71
  第一节基因治疗及其过程  15-25
    1.1.1 基因治疗  15
    1.1.2 基因治疗过程  15-17
    1.1.3 基因治疗过程中的障碍  17-25
  第二节基因载体  25-54
    1.2.1 阳离子脂质体  26-30
    1.2.2 阳离子聚合物  30-48
    1.2.3 树枝状聚合物  48-50
    1.2.4 多肽  50-51
    1.2.5 纳米粒子  51-53
    1.2.6 聚合物水凝胶  53-54
  第三节聚赖氨酸修饰和改性  54-67
    1.3.1 降低细胞毒性，提高复合物纳米粒子稳定性  56-59
    1.3.2 提高复合物纳米粒子与细胞膜间相互作用  59-60
    1.3.3 提高复合物纳米粒子靶向性  60-64
    1.3.4 提高复合物纳米粒子内涵体逃离能力  64-65
    1.3.5 树枝状 PLL  65-67
  第四节课题设计思路  67-71
第二章含糖聚合物修饰的 PLL 基非病毒基因载体  71-100
  第一节前言  71-72
  第二节实验部分  72-82
    2.2.1 主要药品及试剂  72-73
    2.2.2 主要测试仪器及方法  73-74
    2.2.3 化学实验部分  74-79
    2.2.4 生物学表征及测试  79-82
  第三节结果和讨论  82-99
    2.3.1 DPMAEL 的制备  82-83
    2.3.2 PLL-g-DPMAEL 的制备  83-85
    2.3.3 PLL-g-DPMAEL 的细胞毒性  85-88
    2.3.4 PLL 和 PLL-g-DPMAEL 对 pDNA 的压缩能力  88-91
    2.3.5 复合物纳米粒子的稳定性  91-93
    2.3.6 复合物纳米粒子的 Zeta 电位和尺寸  93-95
    2.3.7 体外基因转染  95-99
  第四节结论  99-100
第三章 PLL/pDNA/P(His-co-DMAEL)三元复合物基因载体  100-139
  第一节前言  100-106
  第二节实验部分  106-118
    3.2.1 主要药品及试剂  106-107
    3.2.2 主要测试仪器及方法  107-108
    3.2.3 实验部分  108-118
  第三节结果和讨论  118-138
    3.3.1 P(His-co-DMAEL)的制备  118-120
    3.3.2 三元复合物纳米粒子的形成  120-124
    3.3.3 三元复合纳米粒子在肝素钠，DNase I 以及血清条件下的稳定性  124-128
    3.3.4 三元复合物纳米粒子抗聚集能力  128-131
    3.3.5 体外基因转染  131-135
    3.3.6 复合物纳米粒子细胞内吞效率  135-137
    3.3.7 细胞毒性测试  137-138
  第四节结论  138-139
第四章 P(His-co-DMAEL)引入方式对 PLL 基载体基因转染效率的影响  139-159
  第一节前言  139-140
  第二节实验部分  140-145
    4.2.1 主要药品及试剂  140
    4.2.2 主要测试仪器及方法  140-141
    4.2.3 化学实验部分  141-143
    4.2.4 生物学表征和测试  143-145
  第三节结果和讨论  145-157
    4.3.1 PLL-g-P(His-co-DMAEL)的制备  145
    4.3.2 复合物纳米粒子的制备  145-147
    4.3.3 复合物纳米粒子的尺寸和 Zeta 电位  147-148
    4.3.4 琼脂糖凝胶电泳测试  148-151
    4.3.5 复合物纳米粒子抗聚集能力  151-152
    4.3.6 体外基因转染  152-154
    4.3.7 复合物纳米粒子细胞内吞效率  154-156
    4.3.8 复合物纳米粒子细胞毒性  156-157
  第四节结论  157-159
参考文献  159-212
全文结论  212-214
致谢  214-216
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  216-219

聚赖氨酸基非病毒载体的设计与制备

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