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受限空间中温敏性聚合物对酶的热保护作用

作　者: 陶倩
导　师: 史林启
学　校: 南开大学
专　业: 高分子化学与物理
关键词: 温敏性聚合物酶保护受限空间热失活亚基解离
分类号: O631.3
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

酶作为一种性能优越的生物催化剂,在科学研究和工业生产中有着广泛的应用,然而许多酶在高温时容易相互聚集而失去活性,这严重阻碍了酶的应用化。热聚集的发生是因为酶在变性时肽链展开暴露了其中的疏水位点,所以用疏水性材料将变性酶隔离开是防止酶失活的一种重要方法。然而在水溶液中,由于相转变速度的不同,温敏性聚合物在高温时不能有效地与变性酶(以碳酸脱水酶为模型酶)复合在一起,以实现随环境温度变化自发保护酶的目的。因此,我们设计了一种保护酶免受热失活的新方法。首先,将温敏性聚合物聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)与碳酸脱水酶一同封装入由反相微乳液构筑的受限空间中,高温时PNIPAAm在受限空间中形成纳米尺度的聚集体,这种聚集体既有大的比表面积又有疏水表面,能够通过疏水相互作用吸附变性的酶,以防止酶分子之间发生聚集。低温时,PNIPAAm变得亲水,自发地将酶分子释放出来,使其恢复活性。经酶活性测试证明,这种保护方法可以有效防止碳酸脱水酶的热失活(保护效率可达83.2%)。脂肪酶是一种具有油水界面活性的酶,对许多非水介质中的酶促反应非常重要,但是它的使用也因聚集失活而受到了诸多限制。利用两种具有不同LCST的温敏性聚合物PNIPAAm和聚2-(2-甲氧基乙氧基)乙基甲基丙烯酸酯(PMEO2MA),有效提高了两种脂肪酶在微乳液中的热稳定性,以及在环境温度下的储存稳定性,同时不会破坏酶自身的界面活性。这不仅证明了这种保护方法的有效性和通用性,而且扩展了该方法的实际应用价值。此外,我们还对可能影响热稳定性提高效果的几种因素进行了分析,并通过多种表征手段分析了整个保护过程,提出了作用机理。多亚基酶的热失活过程比较复杂,其失活的第一步通常是亚基解离。仅凭借与材料的疏水相互作用不足以防止亚基解离的发生,因此我们合成了一种温敏性共聚物,接枝有PNIPAAm的壳聚糖(chitosan-g-PNIPAAm),它能随温度变化发生可逆的溶胶-凝胶转变。这种共聚物与多亚基酶共存于受限空间中时,能起到稳定多亚基酶的四级结构,防止其亚基解离的作用。这是因为chitosan-g-PNIPAAm在高温时形成了网状凝胶,包覆在多亚基酶的表面,即使亚基间的相互作用力减弱依然不能解离,而低温时,chitosan-g-PNIPAAm恢复为溶解状态,不会影响到多亚基酶发挥其活性。这种方法能有效防止葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的热失活,是一种通用的保护多亚基酶,防止其亚基解离的方法。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-12
第一章绪论  12-35
  第一节酶的结构及其失活过程  12-15
    1.1.1 酶的结构与应用介绍  12-13
    1.1.2 单亚基酶的失活过程  13-14
    1.1.3 多亚基酶的失活过程  14-15
  第二节防止酶失活的多种方法  15-25
    1.2.1 化学修饰  15-16
    1.2.2 酶的固定化  16-19
    1.2.3 人工分子伴侣  19-23
    1.2.4 防止多亚基酶失活的方法  23-25
  第三节受限空间中的环境敏感性聚合物  25-33
    1.3.1 环境敏感性聚合物  25-28
    1.3.2 受限空间的构筑及其研究意义  28-31
    1.3.3 环境敏感性聚合物在受限空间中的特殊行为  31-33
  第四节选题的目的和意义  33-35
第二章受限空间中温敏性聚合物对单亚基酶的热保护作用  35-59
  第一节实验部分  37-41
    2.1.1 主要化学试剂  37-38
    2.1.2 主要仪器  38
    2.1.3 均聚物聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)的合成  38-39
    2.1.4 嵌段共聚物聚乙二醇-b-聚N-异丙基丙烯酰胺的合成  39-40
    2.1.5 包裹酶和聚合物的微乳液的制备  40
    2.1.6 热失活与复性实验  40
    2.1.7 CAB的酶活性测试  40-41
    2.1.8 光散射样品的制备和测试  41
    2.1.9 原子力显微镜样品的制备和测试  41
  第二节结果与讨论  41-57
    2.2.1 均聚物PNIPAAm的结构表征  41-42
    2.2.2 嵌段共聚物PEG-b-PNIPAAm的结构表征  42-43
    2.2.3 水溶液中温敏性聚合物对酶的热保护作用  43-47
      2.2.3.1 水溶液中PNIPAAm对碳酸脱水酶的热保护  44-45
      2.2.3.2 水溶液中PEG-b-PNIPAAm对碳酸脱水酶的热保护  45-47
    2.2.4 受限空间中温敏性聚合物对酶的热保护作用  47-48
    2.2.5 受限空间中温敏性聚合物对酶的热保护作用的机理探讨  48-55
    2.2.6 受限空间中温敏性聚合物对酶热保护效果的影响因素研究  55-57
      2.2.6.1 聚合物与酶的质量比对热保护效果的影响  55
      2.2.6.2 酶浓度对热保护效果的影响  55-56
      2.2.6.3 加热时间对热保护效果的影响  56-57
  第三节本章结论  57-59
第三章利用温敏性聚合物提高微乳液中脂肪酶的热稳定性  59-81
  第一节实验部分  60-64
    3.1.1 主要化学试剂  60-61
    3.1.2 主要仪器  61-62
    3.1.3 聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAAm)的合成  62
    3.1.4 聚2-(2-甲氧基乙氧基)乙基甲基丙烯酸酯(PMEO_2MA)的合成  62
    3.1.5 包裹有脂肪酶和温敏性聚合物的微乳液的制备  62-63
    3.1.6 热失活与复性实验  63
    3.1.7 脂肪酶的酶活性测试  63-64
    3.1.8 光散射样品的制备和测试  64
    3.1.9 荧光光谱的样品制备和测试  64
  第二节结果与讨论  64-79
    3.2.1 聚2-(2-甲氧基乙氧基)乙基甲基丙烯酸酯的结构表征  64-65
    3.2.2 温敏性聚合物对微乳液中脂肪酶的热稳定性的提高作用  65-68
    3.2.3 温敏性聚合物提高微乳液中脂肪酶热稳定性的影响因素研究  68-71
      3.2.3.1 聚合物浓度对脂肪酶热稳定性提高的影响  68-69
      3.2.3.2 加热温度对脂肪酶热稳定性提高的影响  69-70
      3.2.3.3 微乳液的W_0值对脂肪酶热稳定性提高的影响  70-71
    3.2.4 温敏性聚合物提高微乳液中脂肪酶热稳定性的机理研究  71-77
      3.2.4.1 动态光散射研究  71-74
      3.2.4.2 荧光光谱研究  74-77
    3.2.5 环境温度下温敏性聚合物对微乳液中脂肪酶稳定性的提高作用  77-79
  第三节本章结论  79-81
第四章受限空间中温敏性水凝胶对多亚基酶的热保护作用  81-100
  第一节实验部分  83-87
    4.1.1 主要化学试剂  83-84
    4.1.2 主要仪器  84
    4.1.3 端基为羧基的聚N-异丙基丙烯酰胺的合成  84
    4.1.4 壳聚糖接枝聚N-异丙基丙烯酰胺共聚物的合成  84-85
    4.1.5 共聚物chitosan-g-PNIPAAm的LCST的测定  85
    4.1.6 包裹有多亚基酶和温敏性聚合物的微乳液的制备  85
    4.1.7 热失活与复性实验  85
    4.1.8 葡萄糖氧化酶的酶活性测试  85-86
    4.1.9 过氧化氢酶的酶活性测试  86-87
    4.1.10 流变实验的样品制备和测试  87
    4.1.11 荧光光谱的样品制备和测试  87
  第二节结果与讨论  87-98
    4.2.1 共聚物chitosan-g-PNIPAAm的结构表征  87-88
    4.2.2 共聚物chitosan-g-PNIPAAm的温敏性溶胶-凝胶转化行为  88-91
    4.2.3 chitosan-g-PNIPAAm在受限空间中对多亚基酶的热保护作用  91-94
    4.2.4 chitosan-g-PNIPAAm在受限空间中对多亚基酶的保护机理研究  94-97
    4.2.5 chitosan-g-PNIPAAm在受限空间中对单亚基酶的热保护作用  97-98
  第三节本章结论  98-100
第五章全文结论  100-102
参考文献  102-113
致谢  113-114
个人简历以及在学期间发表的论文和研究成果  114

受限空间中温敏性聚合物对酶的热保护作用

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