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淡水湖泊真核超微藻遗传多样性研究

作　者: 谢薇薇
导　师: 王志伟；史小丽
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 淡水湖泊真核超微藻遗传多样性分选 T-RFLP 环境因子
分类号: Q948.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

真核超微藻(Eukaryotic picophytoplankton)为粒径小于2μm的真核浮游植物。因其具有较大的比表面积和高的碳吸收效率,是水体初级生产力的重要贡献者,在水生生态系统的物质循环和能量流动中起着十分重要的作用。本研究以真核超微藻为材料,探索了真核超微藻遗传多样性的研究方法,分析了30多个淡水湖泊真核超微藻多样性、分布特点及环境影响因子。第一,首先运用流式细胞仪分选及PCR、构建基因克隆库的方法研究太湖、玄武湖和紫霞湖真核超微藻的遗传多样性,在这些湖泊中主要发现了隐藻、金藻、硅藻、绿藻和定鞭藻五大门类。不同湖泊中真核超微藻多样性存在明显差异。隐藻普遍存在于三个湖泊中,金藻更适应水质较好的水域。研究中得到的部分真核超微藻与海洋中的藻聚在一起,可见湖泊与海洋的藻类组成具有一定的相似性,部分真核超微藻适应性强,可以在不同生态系统中广泛生存。第二,本研究对收集真核超微藻的方法进行了改进,用流式细胞仪分选法取代常规滤膜过滤法。样品用量由原来的500mL减少为50mL,单个样品处理时间由原来3h缩短为20min,且分选可有效去除大部分非研究范围内的生物,提高了后续扩增效率,适合大量样品的研究。多样性研究选择了构建基因克隆库和末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)两种方法, T-RFLP法操作简便效率高,单个样品上样时间约20min,短时间内可得到多个样品数据,如要确定具体物种需结合构建基因克隆库法。第三,序列比对结果表明,在得到光合自养型真核超微藻序列的同时,也发现了部分异养超微型原生生物,包括真菌、Alveolate等。表明部分真菌和Alveolate可能以寄生或共生的方式与真核超微藻共存。第四,通过末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)方法调查了长江中下游湖泊真核超微藻多样性。在所调查的所有淡水湖泊中,虽然各湖面积、空间位置及营养状态不同,但均能检测到真核超微藻,说明真核超微藻在淡水湖泊中普遍存在。长江中下游湖泊较多,利用综合营养状态指数法对30个湖泊的营养水平进行了划分,除8个为中营养状态,其他均为富营养状态。第五,长江中下游湖泊真核超微藻多样性研究共发现了196个T-RFs片段,其中9%片段在超过一半的湖泊中都有分布,而45%的片段仅在一个到两个湖中检测到。说明真核超微藻多样性非常丰富,只有少部分种类分布广泛,可以存在于两种以上的生态系统中,而大部分的核超微藻只存在于某一个湖泊的特定生境中。第六,利用流式细胞仪对长江中下游各湖泊的真核超微藻计数,发现富营养化湖泊真核超微藻数量为中营养湖泊的4-5倍。T-RFs片段统计显示,中营养湖泊真核超微藻的T-RFs片段数平均为43,轻度富营养和中度富营养湖泊分别为31、32。表明中营养湖泊真核超微藻数量相对较少,但多样性最为丰富,而富营养化湖泊真核超微藻虽然数量较多,但多样性较低。第七,用CANOCO4.5软件分析不同湖泊真核超微藻多样性与环境因子的相关性。通过去趋势对应分析(DCA)判断其是否具有线性相关关系,具有线性相关关系选择冗余分析(RDA),具有非线性相关关系则选择典型对应分析(CCA)。通过分析发现真核超微藻的多样性与总氮、总磷及Chl a显著相关(p<0.05),说明湖泊中真核超微藻群落结构与水体的营养水平密切相关。本研究初步揭示了淡水湖泊真核超微藻具有丰富的遗传多样性,且不同湖泊多样性差异较大,湖泊真核超微藻的群落结构与营养状态相关。此研究结果利于今后更全面地了解不同湖泊浮游藻类的群落结构。

全文目录

目录  5-9
摘要  9-11
ABSTRACT  11-13
第一部分文献综述  13-40
  1. 真核超微藻的定义及发现  13-15
    1.1 真核超微藻的定义  13-14
    1.2 真核超微藻的发现  14-15
  2. 真核超微藻的研究方法  15-25
    2.1 纯培养法  15-16
    2.2 显微镜观察法  16-20
      2.2.1 光学显微镜  16-17
      2.2.2 电子显微镜  17-18
      2.2.3 荧光显微镜  18-20
    2.3 流式细胞术  20-24
    2.4 分子生物学技术  24-25
      2.4.1 构建克隆文库法  24
      2.4.2 基因组DNA多态性分析法  24-25
      2.4.3 分子杂交技术  25
  3. 真核超微藻的主要类群  25-31
  4. 真核超微藻的国内外相关研究  31-34
    4.1 真核超微藻的国外相关研究  31-32
    4.2 真核超微藻的国内相关研究  32-34
  5. 本研究的主要内容和研究意义  34-35
    5.1 研究内容  34
    5.2 研究意义  34-35
  参考文献  35-40
第一章太湖真核超微藻遗传多样性初探  40-52
  摘要  40
  前言  40-41
  1 材料和方法  41-44
    1.1 实验试剂与仪器  41
      1.1.1 实验试剂  41
      1.1.2 实验仪器  41
    1.2 样品采集  41-42
    1.3 样品基因组DNA的提取  42
    1.4 目的片段的扩增、检测、测序  42-44
      1.4.1 目的片段的扩增  42-43
      1.4.2 目的片段的纯化  43
      1.4.3 目的片段的连接、转化及检测  43-44
      1.4.4 序列比对分析  44
  2 结果与分析  44-47
    2.1 扩增及测序  45
    2.2 序列分析  45-46
    2.3 太湖真核超微藻的遗传多样性  46-47
  3 讨论  47-49
  参考文献  49-52
第二章太湖、玄武湖和紫霞湖真核超微藻的遗传多样性研究  52-68
  摘要  52
  前言  52-53
  1 材料与方法  53-56
    1.1 实验试剂与仪器  53
      1.1.1 实验试剂  53
      1.1.2 实验仪器  53
    1.2 样品采集  53-54
    1.3 样品荧光显微镜观察  54
    1.4 流式细胞仪计数与分选  54-55
    1.5 样品基因组DNA的提取  55-56
    1.6 目的片段的扩增、检测、测序  56
      1.6.1 目的片段的扩增  56
      1.6.2 目的片段的纯化、连接、转化及检测  56
      1.6.3 序列比对分析  56
  2 结果与分析  56-63
    2.1 三个湖泊的水质参数  56-57
    2.2 样品荧光显微镜观察  57-59
    2.3 流式细胞仪分选与计数  59
    2.4 三湖泊真核超微藻的遗传多样性差异  59-60
    2.5 三湖泊优势种群序列分析  60-61
    2.6 系统发育学分析  61-63
    2.7 真核超微藻与环境因子相关性  63
  3 讨论  63-65
  参考文献  65-68
第三章长江中下游湖泊真核超微藻的遗传多样性研究  68-93
  摘要  68
  前言  68-69
  1 材料和方法  69-71
    1.1 实验试剂与仪器  69
      1.1.1 实验试剂  69
      1.1.2 实验仪器  69
    1.2 样品采集  69-70
    1.3 样品荧光显微镜观察  70
    1.4 流式计数分选及基因组DNA的提取  70
    1.5 目的片段的扩增、检测  70-71
    1.6 扩增产物的酶切纯化  71
    1.7 限制性片段长度多态性分析  71
  2 结果与分析  71-87
    2.1 湖泊营养状态评价  71-72
    2.2 湖泊的水质参数分析  72-76
      2.2.1 各湖泊的水质参数  72-74
      2.2.2 不同营养水平湖泊的水质参数分析  74-76
    2.3 样品荧光显微镜观察  76-78
    2.4 流式细胞仪分选与计数  78
    2.5 限制性片段长度多态性分析及聚类分析  78-86
      2.5.1 不同湖泊T-RFs组成的比较  78-84
      2.5.2 不同湖泊T-RFs统计分析  84
      2.5.3 不同湖泊真核超微藻主要片段  84-86
      2.5.4 聚类分析  86
    2.6 真核超微藻与环境因子相关性  86-87
  3 讨论  87-90
  参考文献  90-93
综合讨论  93-100
  参考文献  97-100
全文结论  100-101
附录  101-102
攻读硕士期间发表的学术论文  102-103
致谢  103

淡水湖泊真核超微藻遗传多样性研究

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