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葡萄漆酶的毕赤酵母异源表达纯化及酶学特性与功能研究

作　者: 林亚虬
导　师: 姚泉洪
学　校: 南京农业大学
专　业: 果树学
关键词: 葡萄(Vitis vinifera) 漆酶毕赤酵母异源表达 2,4,6-TCP 染料脱色
分类号: Q946.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

漆酶(EC.1.10.3.2)全称为对-二酚：(双)氧氧化还原酶,目前发现,漆酶广泛存在于真菌、细菌、植物和昆虫中。目前对植物漆酶的研究相对较少,但其在木质素合成、抗病、抗逆,及色素合成等方面研究已取得了一定的成果。葡萄(Grapes),葡萄属(Vitis)落叶藤本植物,几乎占据全世界水果产量的四分之一。葡萄的营养价值很高,其中含有大量的蛋白质、葡萄糖、果糖、酒石酸、草酸及很多微量元素。至今还没有有关葡萄漆酶的研究报道,因此我们合成了葡萄的漆酶基因,通过毕赤酵母分泌表达,研究葡萄漆酶的酶学特性与功能。本研究证明葡萄漆酶在含有染料和酚类化合物的工业污水治理上具有重要应用价值,同时为探索葡萄漆酶在葡萄中的功能提供了理论基础。本文根据在NCBI数据库上公布的葡萄漆酶基因(VvLCC)序列,按毕赤酵母偏爱密码子的偏好性进行改造,用PTDS基因合成法合成适合于甲醇诱导型毕赤酵母表达的葡萄漆酶基因,命名为VvLCCI.为进一步研究葡萄漆酶的酶学特性及相关功能,用电击的方法把含有目的基因(VvLCCI)的真核表达载体pYN2460转化到毕赤酵母基因组中,G418和PCR筛选鉴定出表达活性最高的阳性酵母菌株,将筛选出的菌种用20%甘油保存于-70℃冰箱中。用BMGY和BMMY培养基进行酵母菌株培养和甲醇诱导表达,离心留上清,上清液即为所要的粗酶液,粗酶液在4℃低温下过Ni+柱纯化。用纯化的重组葡萄漆酶研究酶的动力学常数和酶学特性,金属离子和化合物对漆酶活性的影响,染料脱色和2,4,6-TCP降解。研究结果阐明重组葡萄漆酶的最适pH和最适温度分别为3.0和40℃,漆酶在酸性pH和温度低于75℃条件下很稳定；Cu2+对葡萄漆酶活性有很强的促进作用,而Fe2+、L-半胱氨酸和硫代硫酸钠对葡萄漆酶活性有很强的抑制作用；对底物ABTS和愈创木酚的米氏常数Km分别为0.0923和16.8mM, Vmax分别为39.55和10.79mM mg-1min-1。在最佳反应条件下,0.6mM的2,4,6-TCP与葡萄漆酶反应7.5h后降解了87.2%,同时葡萄漆酶对偶氮染料和芳甲烷染料都有很强的脱色能力。

全文目录

摘要  6-7
ABSTRACT  7-9
缩略语说明  9-10
第一章文献综述  10-22
  1 引言  10
  2 漆酶的研究进展  10-17
    2.1 漆酶  10
    2.2 漆酶的来源  10-12
    2.3 漆酶的结构  12-13
    2.4 漆酶催化氧化作用的底物  13
    2.5 漆酶催化氧化反应机理  13
    2.6 漆酶的特性  13-15
    2.7 漆酶的功能与应用  15-17
      2.7.1 漆酶的功能  15-16
      2.7.2 漆酶的应用  16-17
  3 毕赤酵母表达系统  17-20
    3.1 主要优点  17-18
    3.2 常用的菌株类型  18
    3.3 目的基因的整合方式  18-19
    3.4 毕赤酵母表达载体  19
    3.5 提高蛋白表达量的对策  19-20
  4 研究的目的意义及内容  20-22
    4.1 研究的目的意义  20-21
    4.2 研究内容  21-22
第二章葡萄漆酶基因VvLCCI的合成  22-34
  1 材料与方法  22-29
    1.1 试验材料  22-23
    1.2 试验方法  23-29
  2 结果与分析  29-32
    2.1 VvLCCI基因的合成  29-32
  3 讨论  32-34
第三章葡萄漆酶的毕赤酵母异源表达及纯化  34-40
  1 材料与方法  34-38
    1.1 试验材料  34-35
    1.2 试验方法  35-38
  2 结果与分析  38-39
    2.1 葡萄漆酶基因VvLCCI的表达  38
    2.2 葡萄漆酶的纯化及SDS-PAGE鉴定  38-39
  3 讨论  39-40
第四章葡萄漆酶酶学特性的研究  40-48
  1 材料与方法  40-42
    1.1 试验材料  40
    1.2 试验方法  40-42
  2 结果与分析  42-46
    2.1 葡萄漆酶的最适pH和最适温度  42-43
    2.2 Cu~(2+)对漆酶反应体系的影响  43-44
    2.3 葡萄漆酶对两种底物特异性的研究及米氏方程  44
    2.4 葡萄漆酶的pH稳定性和温度稳定性  44-45
    2.5 金属离子和化合物对葡萄漆酶活性的影响  45-46
  3 讨论  46-48
第五章葡萄漆酶对2,4,6-TCP的降解及对染料脱色能力的研究  48-58
  1 材料与方法  48-50
    1.1 主要试剂  48
    1.2 TCP降解  48-49
    1.3 染料脱色  49-50
  2 结果与分析  50-55
    2.1 TCP降解  50-53
    2.2 染料脱色  53-55
  3 讨论  55-58
本文结论与创新点  58-60
参考文献  60-66
附录  66-68
硕士期间发表文章  68-70
致谢  70

葡萄漆酶的毕赤酵母异源表达纯化及酶学特性与功能研究

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