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转Gbve1基因拟南芥对黄萎菌的抗性和机制研究

作　者: 李红娟
导　师: 窦道龙
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 棉花黄萎病 拟南芥 Gbve1基因 RNA-seq技术 抗性机制
分类号: S432.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


棉花黄萎病是全世界棉花生产上危害最重要的病害之一,目前尚无有效的药剂防治措施,被称为棉花的“癌症”。目前该病害防控最为有效的方法是抗病育种,然而目前生产上最为多用的陆地棉还缺乏有效的抗病材料,制约了抗病育种的应用。通过定位和克隆抗病基因,研究它们对黄萎病的抗性及其抗性机制对防治黄萎病至关重要。最近,我们从海岛棉“Hai7124"中克隆了番茄抗黄萎病Ve同源的类受体蛋白基因Gbve1,并通过基因沉默技术和转基因技术证明了Gbve1基因对落叶型和非落叶型的棉花黄萎菌都具有一定抗性；将该基因转化到拟南芥(Arabidopsis)后,发现拟南芥对黄萎病的抗性有了明显增强,表明Gbve1在物种间具有一定的保守性。为了进一步研究Gbve1的抗性机制,本课题筛选了转基因阳性克隆,转Gbve1基因拟南芥和对照植株Co1-0移栽到培养介质中后,通过棉花黄萎菌分生孢子悬浮液灌根法接种,并对其进行发病统计,发现由于Gbve1基因的表达,拟南芥对棉花黄萎菌表现抗性增强,而且,对落叶型V991菌株的抗性差异明显大于非落叶型菌株BP2。随后,我们对转Gbve1基因拟南芥进行了比较详尽的细胞学机制研究。在根部抗性测定中,采用孢子悬浮液蘸根接种法,并对接种后的样品进行染色,发现接种24h后,转基因拟南芥根部胼胝质积累增多,而对照植株中没有明显积累。接种48h,转基因拟南芥中有细胞死亡,对照植株中没有明显细胞死亡,大量侵染菌丝聚集。我们采用离体叶片叶背接种法接种两种拟南芥,发现接种24h,转基因植株叶片中胼胝质沉积明显显著多于对照植株Col-0；采用H202测试盒对接种各个时间段H202含量进行测定,发现48h,转基因拟南芥过氧化氢含量迅速上升,达到一个峰值,经过DAB染色,此时间段转基因拟南芥出现深褐色斑,而对照植株只是浅棕色班,说明此时,转基因拟南芥中过氧化氢含量多于对照植株。细胞程序性死亡是抗病反应的典型表现,通过对48h和72h的接种样品进行台盼蓝染色,发现48h细胞坏死不明显,而在72h,二者着色情况差异明显,转基因拟南芥叶片被染成很深的蓝色,随即对其进行显微观察,发现转基因植物出现细胞坏死,对照植株有大量侵染菌丝出现。本研究分析了转基因拟南芥的一系列基础防卫反应,初步揭示了棉花Gbve1基因可以通过增强拟南芥的胼胝质沉积、过氧化氢积累及细胞死亡等途径,提高对棉花黄萎菌的抗性。为了更加深入认识Gbve1的作用机制,我们对转基因拟南芥进行了表达谱测序及分析。研究发现,Gbve1基因的转入及表达会引起拟南芥多个基因的表达差异性变化,其中1204个基因上调,543个基因下调。推测Gbve1基因进入植物机体内部以后,参与相关基因表达的调控,当有病菌侵入时,转基因植物会迅速识别,从而启动防卫反应。这一研究结果为Gbve1的抗病机制研究提供了新的思路。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-10
引言  10-11
上篇 文献综述  11-26
  第一章 棉花对黄萎菌的抗病机制研究进展  12-26
    1.1 棉花黄萎病概述  12-20
      1.1.1 棉花黄萎病分布与危害  12-13
      1.1.2 棉花黄萎菌形态及鉴定  13-14
      1.1.3 棉花黄萎菌的土壤存活力及在植物中分布  14-15
      1.1.4 棉花黄萎菌寄主范围  15-16
      1.1.5 棉花黄萎菌致病机理  16-17
      1.1.6 棉花黄萎菌致病类型及致病力  17-19
      1.1.7 棉花黄萎病防治现状  19-20
    1.2 棉花对黄萎菌抗病机制研究  20-26
      1.2.1 寄主与病原菌的识别作用  20-21
      1.2.2 棉花对黄萎菌的结构抗性  21-22
      1.2.3 棉花对黄萎菌的生理生化抗性  22-23
      1.2.4 棉花对黄萎菌的生态抗性  23
      1.2.5 转基因抗黄萎病的研究  23-26
下篇 研究内容  26-74
  第二章 转Gbvel基因拟南芥对黄萎菌抗性鉴定  28-36
    摘要  28
    ABSTRACT  28-30
    2.1 材料与方法  30-32
      2.1.1 培养基  30
      2.1.2 实验器材  30
      2.1.3 实验试剂  30
      2.1.4 供试材料  30-31
      2.1.5 培养条件  31
      2.1.6 试验方法  31-32
    2.2 结果与分析  32-34
      2.2.1 转基因拟南芥的筛选  32
      2.2.2 转基因拟南芥对棉花黄萎菌的抗性测定  32-34
    2.3 结论与讨论  34-36
  第三章 转Gbvel基因拟南芥抗黄萎菌的细胞学机制分析  36-50
    摘要  36
    ABSTRACT  36-37
    3.1 材料与方法  37-41
      3.1.1 培养基  37-38
      3.1.2 实验器材  38
      3.1.3 供试材料  38
      3.1.4 培养条件  38-39
      3.1.5 试验方法  39-41
      3.1.6 数据处理  41
    3.2 结果与分析  41-47
      3.2.1 根部抗性表现  41-43
      3.2.2 叶部抗性表现  43-47
    3.3 结论与讨论  47-50
  第四章 转棉花Gbvel基因拟南芥的RNA表达谱分析  50-74
    摘要  50
    ABSTRACT  50-52
    4.1 材料与方法  52-61
      4.1.1 培养基  52
      4.1.2 实验器材  52
      4.1.3 供试材料  52-53
      4.1.4 试验方法  53-61
    4.2 结果与分析  61-72
      4.2.1 样品检测  61
      4.2.2 测序质量的评估  61-62
      4.2.3 饱和度测定  62-63
      4.2.4 实验重复性分析  63
      4.2.5 基因注释  63-64
      4.2.6 GO分析  64-65
      4.2.7 筛选差异表达基因(differential expression genes,DEGs)  65-66
      4.2.8 差异表达基因的GO显著富集分析  66-72
    4.3 结论与讨论  72-74
结论  74-76
参考文献  76-82
附录  82-88
  参考文献  87-88
攻读硕士学位期间发表的研究论文  88-90
致谢  90

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 植物病害及其防治 > 侵（传）染性病害
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